Bacillus anthracis ve Diğer Kapsüllenmiş Patojenlere Karşı Aşı Geliştirmede Fonksiyonel Antikorları Değerlendirmek için Opsono-Adherence Tahlili
Summary
Opsono-bağlılık testi, antikorların aşı geliştirmedeki opsonik fonksiyonlarını değerlendirmek için opsono-fagositik öldürme testine alternatif bir yöntemdir.
Abstract
Opsono-yapışma tahlili, bakteriyel patojenlerin profesyonel fagositlere bağlanmasını numaralayan işlevsel bir testtir. Fagositoz ve öldürme için bağlılık gerekli olduğundan, tahlil opsono-fagositik öldürme testlerine alternatif bir yöntemdir. Opsono-yapışma testinin bir avantajı, birden fazla deneyde standardizasyona izin veren inaktive patojenleri ve memeli hücre hatlarını kullanma seçeneğidir. Testte inaktive bir patojenin kullanılması, biyogüvenlik seviyesi 3 enfeksiyöz ajanlar ve diğer virülan patojenlerle çalışmayı da kolaylaştırır. Çalışmamızda, opsono-yapışmış test, şarbon kapsülü bazlı bir aşı ile aşılanmış hayvanların serasından, sabit Bacillus anthracis’in fare makrofaj hücresi hattı RAW 264.7’ye yapışmasını teşvik etmek için antikorların fonksiyonel yeteneğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Makrofajlara bağlı basil görüntülerini yakalamak için otomatik floresan mikroskopisi kullanıldı. Serumda anti-kapsül antikorlarının varlığı ile artan yapışlık ilişkiliydi. Yüksek serum anti-kapsül antikor konsantrasyonları sergileyen insan olmayan primatlar şarbon zorluğundan korundu. Bu nedenle, opsono-yapışıklık testi, seradaki antijen spesifik antikorların biyolojik işlevlerini aydınlatmak, aşı adaylarının ve diğer terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek ve bağışıklığın olası bir korelasyon olarak hizmet etmek için kullanılabilir.
Introduction
Bir patojenin tanınması, yapışması, içselleştirilmesi ve bozulması fagositozun ayrılmaz bir parçasıdır 1 , ilk olarakIlyaMetchnikoff tarafından 1883’te tanımlanan konakçı doğuştan gelen immün yanıtta belirgin bir yol2,3. Fagositik lökositler ve bağışıklık sisteminin diğer hücreleri, hedef seçimlerinde son derece ayrımcıdır; patojen ilişkili moleküler desenler aracılığıyla “enfeksiyöz olmayan benlik” ile “enfeksiyöz olmayan benlik” arasında, örüntü tanıma reseptörleri (PRR) repertuarları (PRR)4,5ile ayırt edebiliyorlar. Bir patojenin konak tanıması, tamamlayıcı ve antikorlar gibi konak opsoninlerin bağlanmasıyla da ortaya çıkabilir6. Opsonizasyon adı verilen bu işlem, patojeni bu moleküllerle kaplar, fagositik hücreler üzerindeki opsonik reseptörlere (örneğin, kompleman ve Fc reseptörleri) bağlanması üzerine içselleştirmeyi artırır6. Bir patojenin bir fagositlere yapışması için, birden fazla reseptörün konyak ligandları ile kolektif olarak bağlanması gereklidir. Ancak o zaman içselleştirmeyi başlatmak için ana hücre içinde sinyal basamaklarını yapıştırma tetikleyicisi ve sürdürebilir6.
Patojenlerin temizlenmesinde ve enfeksiyonun önlenmesinde fagositozun önemi nedeniyle, hücre dışı patojenler hayatta kalmalarını uzatmak için bu süreci altüst etmenin birçok yolunu geliştirmiştir. Önemli bir strateji, yükü nedeniyle fagositik olmayan, zayıf immünojenik olan ve bakteriyel zarf üzerindeki molekülleri PRR6,7’denkoruyan bir anionik polimerik (örneğin, polisakkarit veya poliamino asit) kapsülünün üretimidir. Cryptococcus neoformans ve Streptococcus pneumoniae gibi patojenler sakkarit polimerlerden oluşan kapsüllere sahipken, Staphylococcus epidermidis ve bazı Bacillus türleri poli-ɣ glutamik asit (PGGA)7,8üretir. Yine de diğer patojenler bulaşıcı olmayan benliğe benzeyen kapsüller üretir. Örneğin, Streptococcus pyogenes ve B. cereus’un patojenik bir suşu, sadece fagositik olmayan, aynı zamanda bağışıklık sistemi tarafından yabancı olarak tanınmayabilecek bir hyaluronik asit kapsülüne sahiptir9,10.
Kapsülün taşıyıcı proteinlere konjugasyonu, onları zayıf, T-bağımsız antijenlerden, yüksek serum anti-kapsül antikor titrelerine neden olabilecek yüksek immünojenik T bağımlı antijenlere dönüştürür11,12. Bu strateji S. pneumoniae, Haemophilus influenzaeve Neisseria meningitides11’ekarşı lisanslı aşılar için kullanılır. Anti-kapsül antikorların opsonik aktiviteleri genellikle opsono-fagositik öldürme tahlilleri (OPKA)13 , 14,15,16ile değerlendirilmiştir. Bu tahliller fonksiyonel antikorların fagositozu tetikleyip tetikleyemeyeceği ve14. Bununla birlikte, OPKA’nın B. anthracis17de dahil olmak üzere Tier 1 Biyolojik Selani Ajanlar ve Toksinler (BSAT) gibi enfeksiyöz patojenlerle kullanımı tehlikelidir ve güvenlik riskleri sunar; bu tahliller, seçilmiş bir ajanın kapsamlı bir şekilde ele alınmasını gerektirir. Belirli ajan işleme sadece sınırlı biyogüvenlik seviye 3 (BSL-3) laboratuvarlarında yapılabilir; bu alanlarda çalışmak, uyulması gereken çok sayıda güvenlik ve emniyet önlemi nedeniyle uzun süreli çalışma prosedürleri talep eder. BSL-3 laboratuvarları da tipik olarak mikroskoplar ve sitometreler gibi OPKA çalışmaları için kullanılan özel ekipmanlarla donatılmamıştır. Böylece, inaktive bakteri kullanımına dayalı alternatif bir test geliştirdik18,19. Buna, içselleştirme ve öldürme tahlil çıktılarına bağlı olmayan bir opsono-bağlılık tahlil (OAA) olarak adlandırıyoruz; bunun yerine, opsonize inaktive patojenlerin yapışmışlığı fagositoz indeksi olarak kullanılır. Mekanistik olarak, OAA uygun bir alternatiftir, çünkü bağlılık bir priori meydana gelir ve içselleştirme ve hücre içi öldürme ile yakından iç içedir. Biyogüvenlik açısından bakıldığında, OAA enfeksiyöz bir ajanın minimum şekilde işlenmesini gerektirdiğinden, deneysel olarak OPKA’dan daha kısa süreli olduğundan ve inaktive patojen stoğu üretildikten ve aktarıldıktan sonra BSL-2 laboratuvarlarında gerçekleştirilebildiği için tercih edilir.
Neisseria meningitidlerinindış zar protein kompleksine (OMPC) konjuge edilen bir kapsül konjuge ile aşılanmış insan dışı primatların (NHP’ler) serasında bulunan anti-kapsül antikorlarının opsonik işlevini incelemek için OAA’nın kullanımını gösteriyoruz ]20. Serum opsonize basili, raw 264.7 adlı bir fare makrofaj hücre hattı ile inkübe edildi. Fiksasyondan sonra hücre monolayer ve yapışan basil floresan mikroskopi ile görüntülenmiştir. Bakteriyel yapışma, kapsül konjuge ile aşılanan NHP’lerden serum ile inkübe edildiğinde kontrol serumu20’yekıyasla artmıştır. Yapışlık şarbon mücadelesinin hayatta kalması ileilişkilidir 20,21. Bu nedenle, OAA kullanımı anti-kapsül antikorlarının işlevini karakterize etti ve aşı adayımızın testini büyük ölçüde kolaylaştırdı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kapsül bazlı aşıların çok sayıda bakteriyel patojene karşı etkili olduğu gösterilmiştir ve birçoğu insanlarda kullanım için lisanslıdır25,26,27. Bu aşılar kapsülü hedef alan antikorlar üreterek çalışır ve bu çalışmaların çoğu OPKA’yı13 , 14 , 16,28,29antikor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazıda açıklanan prosedürleri J. Chua, D. Chabot ve A. Friedlander tasarladı. Deneyleri J. Chua ve T. Putmon-Taylor yaptı. D. Chabot veri analizi yaptı. Taslağı J. Chua yazdı.
Yazarlar Kyle J. Fitts’e mükemmel teknik yardım için teşekkür ediyor.
Çalışma, Savunma Tehdit Azaltma Ajansı hibe CBM tarafından desteklendi. VAXBT.03.10.RD.015, plan numarası 921175.
Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve tavsiyeler yazarların görüşleridir ve mutlaka ABD Ordusu tarafından onaylanmamıştır. Bu yayının içeriği, Savunma Bakanlığı’nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmak zorunda değildir ve ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsedilmesi ABD Hükümeti tarafından onay anlamına gelmez.
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
References
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition) Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011)
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. . Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , 243-255 (2013).
