إن فحص أوبوسونو- الالتزام هو طريقة بديلة لتشقيم القتل الفاتجية من مكتب العمليات لتقييم الوظائف opsonic للأجسام المضادة في تطوير اللقاحات.
مقايسة opsono الالتزام هو اختبار وظيفية أن يعدد تعلق مسببات الأمراض البكتيرية إلى البلعات المهنية. لأن الالتزام هو شرط لالبالمعموم والقتل، والمقايسة هو طريقة بديلة لopsono-الفاتغة القتل المقايسة. ميزة من اختبار opsono الالتزام هو خيار استخدام مسببات الأمراض المعطلة وخطوط الخلايا الثديية ، والذي يسمح بتوحيد عبر تجارب متعددة. كما أن استخدام مسببات الأمراض المعطلة في الفحص يسهل العمل مع عوامل عدوى من المستوى 3 في مجال السلامة البيولوجية وغيرها من مسببات الأمراض الخبيثة. في عملنا، تم استخدام اختبار الالتزام opsono لتقييم القدرة الوظيفية للأجسام المضادة، من سيرا من الحيوانات المحصنة مع لقاح كبسولة الجمرة الخبيثة، للحث على الالتزام بالجمرة الخبيثة عصيات ثابتة لخط خلية الضامة الماوس، RAW 264.7. تم استخدام المجهر الفلورسي الآلي لالتقاط صور للعصيات التمسك الضامة. وارتبطت زيادة الالتزام بوجود أجسام مضادة للكبسولات في المصل. وكانت الرئيسيات غير البشرية التي أظهرت تركيزات عالية من الأجسام المضادة للكبسولات في المصل محمية من تحدي الجمرة الخبيثة. وهكذا، يمكن استخدام اختبار الالتزام opsono لتوضيح الوظائف البيولوجية للأجسام المضادة المستضدية المحددة في سيرا، لتقييم فعالية المرشحين لقاح والعلاجات الأخرى، وتكون بمثابة ارتباط ممكن من المناعة.
الاعتراف، والالتزام، واستيعاب، وتدهور الممرض هي جزء لا يتجزأ من البلعموم1، وهو مسار بارز في الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة وصفها أولا Ilya Metchnikoff في 18832،3. الكريات البيض البلعوية، وكذلك خلايا أخرى في الجهاز المناعي، هي تمييزية للغاية في اختيارها من الأهداف؛ فهي قادرة على التمييز بين “المعدية غير الذاتي” و “غير المعدية الذاتي” من خلال أنماط مسببات الأمراض المرتبطة الجزيئية من قبل ذخيرة من مستقبلات التعرف على نمط (PRRs)4،5. قد يحدث أيضا اعتراف المضيف من مسببات الأمراض مع ربط أوبسونين المضيف، مثل الأجسام المكملة والأضداد6. هذه العملية، ودعا opsonization، المعاطف الممرض مع هذه الجزيئات، وتعزيز استيعاب عند ملزمة لمستقبلات opsonic (على سبيل المثال، مكملة ومستقبلات Fc) على الخلايا البلعومية6. بالنسبة لمسببات الأمراض للتمسك بالبلع، فإن الربط الجماعي لمستقبلات متعددة مع أربطةها المشتركة ضروري. وعندئذ فقط يمكن أن يؤدي الالتزام وإبقاء الشلالات إشارة داخل الخلية المضيفة لبدء استيعاب6.
نظرًا لأهمية البلعوم في إزالة مسببات الأمراض والوقاية من العدوى ، فقد طورت مسببات الأمراض خارج الخلية العديد من الطرق لتخريب هذه العملية لإطالة بقائها. استراتيجية واحدة من أهمية هو إنتاج البوليمرية anionic (على سبيل المثال، السكريات أو حمض البوليمينو) كبسولة التي هي المضادة للبولي فيغوسيتيك بحكم شحنتها، هو ضعف المناعة، والدروع جزيئات على المغلف البكتيري من PRRs6،7. مسببات الأمراض مثل Cryptococcusformans neoformans وStreptoptococcus pneumoniae كبسولات تتكون من البوليمرات saccharide ، في حين أن البشرة المكورات العنقودية وبعض أنواع Bacillus تنتج حمض poly-ɣ-glutamic (PGGA)7،8. ومع ذلك مسببات الأمراض الأخرى تنتج كبسولات تشبه النفس غير المعدية. على سبيل المثال، Pyogenes العقديات وسلالة مسببة للأمراض من B. cereus لديها كبسولة حمض الهيالوروني ليس فقط المضادة للبالثومية ولكن التي قد لا يتم الاعتراف بها أيضا الأجنبية من قبل الجهاز المناعي9،10.
الاقتران من كبسولة إلى البروتينات الناقل يحولهم من الفقراء, T-مستقلة المستضدات إلى مستضدات تعتمد على درجة عالية من المناعة T-تعتمد على أن يمكن أن تحفز عالية مصل المضادة للكبسولاتاتراتالأجسام المضادة 11,12. يتم استخدام هذه الاستراتيجية للقاحات مرخصة ضد S. الالتهاب الرئوي, الهيموفلوس الأنفلونزا, ونيسيريا التهاب السحايا11. وقد تم تقييم الأنشطة opsonic من الأجسام المضادة للكبسولات المضادة عادة من قبل opsono-الفاتغة القتل المقايسات (OPKA)13,14,15,16. هذه الاختبارات اختبار ما إذا كانت الأجسام المضادة الوظيفية يمكن أن تؤدي إلى البلعوم وقتل14. ومع ذلك، فإن استخدام مادة OPKA مع مسببات الأمراض المعدية، مثل عوامل الاختيار البيولوجية من المستوى 1 والتكسينات (BSAT)، بما في ذلك B. ANTHRACIs17، هو استخدام خطير ويعرض مخاطر أمنية؛ هذه المقايسات تتطلب معالجة واسعة النطاق من وكيل مختارة. لا يمكن أن يتم التعامل مع عوامل مختارة إلا في مختبرات المستوى المقيد للسلامة الأحيائية 3 (BSL-3)؛ يتطلب العمل في هذه المجالات إجراءات تشغيل مطولة بسبب العديد من احتياطات السلامة والأمن التي يجب اتباعها. كما أن مختبرات BSL-3 غير مجهزة عادة بالمعدات المتخصصة المستخدمة في أعمال OPKA، مثل المجاهر وأجهزة قياس السيت. وهكذا، قمنا بتطوير فحص بديل على أساس استخدام البكتيريا المعطلة18،19. ونشير إلى ذلك على أنه مقايسة للانضمام إلى مكتب العمليات لا تعتمد على النواتج المُستوعبة والقتل كمعان؛ بدلا من ذلك، يتم استخدام الالتزام مسببات الأمراض opsonized المعطلة كفهرس للبطلات. ميكانيكيا، OAA هو بديل مناسب لأن الالتزام يحدث مسبقا وتتشابك بشكل وثيق مع الداخل والقتل داخل الخلايا. ومن منظور السلامة الأحيائية، يفضل اغورا لأنه يتطلب الحد الأدنى من معالجة العامل المعدي، وهو تجريبي أقصر مدة من OPKA، ويمكن إجراؤه في مختبرات BSL-2 بعد أن يتم إنتاج ونقل مخزون من مسببات الأمراض المعطلة.
نحن نبرهن على استخدام OAA لفحص وظيفة opsonic من الأجسام المضادة للكبسولات المضادة وجدت في سيرا من الرئيسيات غير البشرية (NHPs) تطعيمها مع مركب كبسولة [أي PGGA من B. الجمرة الخبيثة مترافق إلى مجمع البروتين الغشاء الخارجي (OMPC) من التهاب السحايا Neisseria]20. تم احتضان عصيات المصل opsonized مع خط خلية الضامة الماوس الملتزم، RAW 264.7. بعد التثبيت ، تم تصوير الخلية أحادية الطبقات وعصيات المتمسك بها عن طريق المجهر المفلور. ازدادت نسبة الإلتزام البكتيري عندما تم احتضان العصيات بالمصل من NHPs التي تم تطعيمها بـ كبسولات مترافقة مقارنة بالمصل20. الالتزام يرتبط مع البقاء على قيد الحياة من التحدي الجمرة الخبيثة20,21. وهكذا، فإن استخدام اأو يتميز وظيفة الأجسام المضادة للكبسولات و سهل إلى حد كبير اختبار مرشح اللقاح لدينا.
وقد ثبت أن اللقاحات القائمة على كبسولة تكون فعالة ضد العديد من مسببات الأمراض البكتيرية، والعديد منها مرخص للاستخدام في البشر25،26،27. تعمل هذه اللقاحات عن طريق توليد الأجسام المضادة التي تستهدف الكبسولة والعديد من هذه الدراسات تستخدم OPKA ?…
The authors have nothing to disclose.
وقد صمم ج. تشوا و د. شابوت وأ. فريدلاندر الإجراءات الموصوفة في المخطوطة. وقد أجرى ج. تشوا وت. بوتمون – تايلور التجارب. دال- أجرى شابوت تحليل البيانات. ج. تشوا كتب المخطوطة.
يشكر المؤلفون كايل ج. فيت على المساعدة التقنية الممتازة.
وقد دعم هذا العمل منحة وكالة الحد من التهديدات الدفاعية. VAXBT.03.10.RD.015، رقم الخطة 921175.
الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي آراء المؤلفين ولا يؤيدها بالضرورة الجيش الأمريكي. لا يعكس محتوى هذا المنشور بالضرورة وجهات نظر أو سياسات وزارة الدفاع، كما لا يعني ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات تأييدًا من قبل حكومة الولايات المتحدة.
0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |