Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati
Summary
Il saggio opsono-aderenza è un metodo alternativo al saggio di uccisione opsono-fagocitica per valutare le funzioni opsoniche degli anticorpi nello sviluppo del vaccino.
Abstract
Il saggio opsono-aderenza è un saggio funzionale che enumera l’attaccamento di agenti patogeni batterici ai fagociti professionisti. Poiché l’aderenza è necessaria per la fagocitosi e l’uccisione, il saggio è un metodo alternativo ai test di uccisione opsono-fagocitica. Un vantaggio del saggio opsono-aderenza è la possibilità di utilizzare agenti patogeni inattivati e linee cellulari di mammiferi, che consente la standardizzazione in più esperimenti. L’uso di un agente patogeno inattivato nel saggio facilita anche il lavoro con agenti infettivi di livello di biosicurezza 3 e altri agenti patogeni virulenti. Nel nostro lavoro, il saggio opsono-aderenza è stato utilizzato per valutare la capacità funzionale degli anticorpi, dai sieri di animali immunizzati con un vaccino a base di capsula di antrace, per indurre l’aderenza del Bacillus anthracis fisso a una linea cellulare di macrofagi del topo, RAW 264.7. La microscopia a fluorescenza automatizzata è stata utilizzata per catturare immagini di bacilli che aderiscono ai macrofagi. L’aumento dell’aderenza è stato correlato con la presenza di anticorpi anti-capsula nel siero. I primati non umani che mostravano alte concentrazioni di anticorpi anti-capsula sierati erano protetti dalla sfida dell’antrace. Pertanto, il saggio opsono-aderenza può essere usato per chiarire le funzioni biologiche degli anticorpi specifici dell’antigene nei sieri, per valutare l’efficacia dei candidati al vaccino e di altre terapie e per servire come possibile correlato dell’immunità.
Introduction
Riconoscimento, aderenza, internalizzazione e degradazione di un agente patogeno sono parte integrante della fagocitosi1, una via saliente nella risposta immunitaria innata dell’ospite descritta per la prima volta da Ilya Metchnikoff nel 18832,3. I leucociti fagocitici, così come altre cellule del sistema immunitario, sono altamente discriminatori nella loro selezione di bersagli; sono in grado di distinguere tra “non-sé infettivo” e “sé non infettivo” attraverso modelli molecolari associati agli agenti patogeni per il loro repertorio di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)4,5. Il riconoscimento dell’ospite di un agente patogeno può verificarsi anche con il legame delle opsonine ospiti, come complemento eanticorpi 6. Questo processo, chiamato opsonizzazione, ricopri l’agente patogeno con queste molecole, migliorando l’internalizzazione al legame con i recettori opsonici (ad esempio, complemento e recettori Fc) sulle cellule fagocitiche6. Affinché un agente patogeno aderisca a un fagocita, è necessario il legame collettivo di più recettori con i loro ligandi affini. Solo allora l’aderenza può attivare e sostenere le cascate di segnalazione all’interno della cella host per avviare l’internalizzazione6.
A causa dell’importanza della fagocitosi nella clearance degli agenti patogeni e nella prevenzione delle infezioni, gli agenti patogeni extracellulari hanno sviluppato numerosi modi per sovvertire questo processo per prolungarne la sopravvivenza. Una strategia importante è la produzione di una capsula polimerica anionica (ad esempio polisaccaride o poliaminoacido) che è anti-fagocitica in virtù della sua carica, è scarsamente immunogenica e protegge le molecole sull’involucro batterico dai PRR6,7. Agenti patogeni come Cryptococcus neoformans e Streptococcus pneumoniae hanno capsule composte da polimeri saccharide, mentre Staphylococcus epidermidis e alcune specie di Bacillus producono acido poli-ɣ-glutammico (PGGA)7,8. Tuttavia, altri agenti patogeni producono capsule che assomigliano all’io non infettivo. Ad esempio, lo Streptococcus pyogenes e un ceppo patogeno di B. cereus hanno una capsula di acido ialuronico che non è solo anti-fagocitico ma che potrebbe anche non essere riconosciuta come estranea dal sistema immunitario9,10.
La coniugazione della capsula in proteine portanti li converte da antigeni poveri e indipendenti dalla T in antigeni altamente immunogenici dipendenti da T che possono indurre alti tigatori di anticorpi anti-capsula sierati11,12. Questa strategia viene utilizzata per i vaccini autorizzati contro S. pneumoniae, Haemophilus influenzaee Neisseria meningitides11. Le attività opsoniche degli anticorpi anti-capsula sono state comunemente valutate da test di uccisione opsono-fagocitica (OPKA)13,14,15,16. Questi test testano se gli anticorpi funzionali possono innescare la fagocitosi e uccidere14. Tuttavia, l’uso di OPKA con agenti patogeni infettivi, come agenti e tossine di selezione biologica di livello 1 (BSAT), tra cui B. anthracis17, è pericoloso e presenta rischi per la sicurezza; questi saggi richiedono un’ampia gestione di un agente selezionato. La manipolazione di agenti selezionati può essere effettuata solo in laboratori di livello di biosicurezza limitato 3 (BSL-3); il lavoro in questi settori richiede procedure operative prolungate a causa delle numerose precauzioni di sicurezza che devono essere seguite. Anche i laboratori BSL-3 in genere non sono dotati delle attrezzature specializzate utilizzate per il lavoro OPKA, come microscopi e citometri. Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio alternativo basato sull’uso di batteri inattivati18,19. Ci riferiamo a questo come un saggio opsono-aderenza (OAA) che non dipende dall’internalizzazione e dall’uccisione delle uscite di saggio; invece, l’aderenza di agenti patogeni inattivati opsonizzati è usata come indice di fagocitosi. Meccanicamente, L’OAA è un sostituto adatto perché l’aderenza avviene a priori ed è intimamente intrecciata con l’internalizzazione e l’uccisione intracellulare. Dal punto di vista della biosicurezza, l’OAA è preferito perché richiede una manipolazione minima di un agente infettivo, è sperimentalmente di durata inferiore rispetto all’OPKA e può essere eseguito nei laboratori BSL-2 dopo che uno stock di agente patogeno inattivato è stato prodotto e trasferito.
Dimostriamo l’utilizzo dell’OAA per esaminare la funzione opsonica degli anticorpi anti-capsule trovati nei sieri di primati non umani (NMP) vaccinati con un coniugato a capsula [cioè PGGA da B. anthracis coniugato al complesso proteico della membrana esterna (OMPC) di Neisseria meningitides]20. I bacilli opsonizzati al siero sono stati incubati con una linea cellulare di macrofagi di topo aderente, RAW 264.7. Dopo la fissazione, il monostrato cellulare e i bacilli aderenti sono stati immaginiti dalla microscopia a fluorescenza. L’aderenza batterica è aumentata quando i bacilli sono stati incubati con siero da NSP vaccinati con il coniugato della capsula rispetto al siero di controllo20. Aderenza correlata alla sopravvivenza della sfida dell’antrace20,21. Pertanto, l’uso di OAA ha caratterizzato la funzione degli anticorpi anti-capsula e ha notevolmente facilitato il test del nostro candidato vaccino.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vaccini a base di capsule hanno dimostrato di essere efficaci contro numerosi agenti patogeni batterici e molti sono autorizzati perl’uso nell’uomo 25,26,27. Questi vaccini funzionano generando anticorpi mirati alla capsula e molti di questi studi utilizzano l’OPKA per mostrare le funzioni opsono-fagocitichedegli anticorpi 13,14,16,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Chua, D. Chabot e A. Friedlander disegnano le procedure descritte nel manoscritto. J. Chua e T. Putmon-Taylor eseguirono gli esperimenti. D. Chabot ha eseguito l’analisi dei dati. J. Chua scrisse il manoscritto.
Gli autori ringraziano Kyle J. Fitts per l’eccellente assistenza tecnica.
Il lavoro è stato supportato dalla concessione della Defense Threat Reduction Agency CBM. VAXBT.03.10.RD.015, piano numero 921175.
Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dall’esercito degli Stati Uniti. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Difesa, né la menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implica l’approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
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