마이크로 패턴 세포에서 세포 외세포증의 주당 측량 파라미터를 정량화
Summary
미세 패턴 세포에 리소소피 외세포증의 라이브 이미징이 이 과정의 공간 적정화를 허용한다. 마이크로 패턴을 이용한 형태 학 정상화는 세포 프로세스의 공간 분포에 대한 일반적인 규칙을 발견하는 뛰어난 도구입니다.
Abstract
pHluorin 태그 용불성 N-ethylmalimide-민감한 인자 부착 단백질 REceptor (v-SNARE) 총 내부 반사 형광 현미경 검사법 (TIRFM)에 의해 소포 관련 멤브레인 단백질 7 (VAMP7)의 라이브 이미징은 리소말 구획에서 분비를 탐구하는 간단한 방법입니다. 마이크로패턴 표면에서 세포 배양을 활용하여 세포 형상을 정상화하기 위해 다양한 통계 도구를 사용하여 분비 패턴의 공간 분석을 수행했습니다. 리플리의 K 기능과 가장 가까운 이웃 거리(NND)를 기반으로 한 통계 테스트를 사용하여 리소좀의 분비가 무작위 과정이 아니라 상당한 클러스터링을 나타낸다는 것을 확인했습니다. 참고로, 우리의 분석은 외세포증 사건이 또한 미적혈 부위에 클러스터된다는 것을 밝혔습니다, 접착 분자가 플라즈마 막에 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조물이 아니라는 것을 표시하. 그럼에도 불구하고 세포 접착력이 클러스터링을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 정확하게 정의된 접착제 및 미적 영역 외에도 이러한 미세 패턴의 원형 형상을 사용하면 극좌표를 사용하여 해석을 단순화할 수 있습니다. 엑소세포증 의 극성 좌표에 커널 밀도 추정(KDE)과 누적 분포 기능을 사용하여 외세포증의 농축 영역을 식별했습니다. 링 모양의 마이크로패턴 세포에서 접착제와 무나정 영역 사이의 경계에서 클러스터링이 발생했습니다. 우리의 분석은 다양한 생물학적 과정의 공간 분포를 조사하기 위해 통계 도구를 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
Introduction
외세포증은 소포가 플라즈마 멤브레인과 융합되어 그 함량을 방출하는 보편적 인 세포 과정입니다. 소포는 플라즈마 멤브레인 (전체 융합)과 완전히 융합하거나 제한된 시간 동안 열려있는 융합 모공을 만들 수 있습니다 (키스 앤 런)1. 예를 들면, 새로 합성된 단백질은 골지 복합체에서 온 소포에서 세포외 배지로 풀어 놓입니다. 이 생합성, 전방 급료 경로는 원시, 특히 다세포 유기체에서 신호 펩티드 (예를 들어, 호르몬, 신경 전달 물질) 및 세포 외 매트릭스 구성 요소 (예를 들어, 콜라겐)를 분비뿐만 아니라 플라즈마 막에 대막 단백질을 트래픽. 추가적으로, 분비물은 다른 내분모에서 생길 수 있습니다: 1) 막 단백질을 재사용하기 위하여 내모를 재활용; 2) 다중 혈관 몸 (MVBs) 엑소좀을 방출; 및 3) 프로테오리틱 효소의 방출을 위한 리소좀. 내뇌 분비는 중성염 아웃성장, 의사포디아 형성, 혈장 막 수리 및 ATP 의존신호2에중요한 것으로 나타났다.
단일 세포 수준에서 외세포증을 연구하기 위해 여러 가지 기술이 사용되었습니다. 패치 클램프는 다양한 살아있는 세포3에서높은 시간적 해상도로 단일 외세포증 이벤트를 검출할 수 있게 한다. 그러나 이 방법은 외세포증 이벤트의 국소화에 대한 정보도, 어떤 구획이 발생하는지에 대한 정보를 제공하지 않는다. 전자 현미경 검사는 높은 공간 해상도를 가진 외세포 사건의 직접 시각화를 허용하고, 면역 라벨링과 함께 관련된 구획 및 분자의 특이성에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법의 단점은 프로세스의 역학에 대한 정보의 부족뿐만 아니라 높은 처리량 연구를 수행 할 수 없다는 것입니다. 커버슬립(100nm) 부근에서 형광을 비추기 위해 에반에센드 필드를 이도하는 총 내부 반사 형광 현미경 검사법(TIRFM)과 같은 경현미경접근법은 외세포증 사건을 연구하기 위한 좋은 시간적 및 공간 적 해상도를 제공한다. 그러나 이 방법은 부착 된 세포와만 호환되며 세포의 복부 / 열등한 부분에만 적용 할 수 있습니다.
참고로, 플라즈마 멤브레인은 제한된 영역에만 존재하는 접착제 복합체를 기반으로 상당한 이질성을 드러냅니다. 이 이질성은 예를 들어, 다른 리간드4의섭취를 제한합니다. 유사하게, 최근에는 골기 복합체로부터의 분비가 혈장 막5의“핫스팟”에 집중되어 있는 것으로 보고되고 있다. 더욱이, 특정 화물은 초점 접착 관련 엑소시토시스6을통해 분비되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 외세포증 이벤트가 공간에 무작위로 분포되는지, 아니면 혈장 막의 특정 부위에 집중되는지 여부에 대한 질문에 특별한 주의를 기울여야 한다. Ripley의 K 함수를 기반으로 한 여러 통계 도구는 이러한 질문을 탐구하기 위해 제안되었습니다7,,8,,9. 우리의 접근은 세포 모양 및 플라즈마 막 이질성을 통제하기 위하여 마이크로패터닝과 이 공구를 결합합니다. 접착제와 미적 영역을 구별하는 수단을 제공하는 것 외에도 이 기술은 다른 세포및 조건에 걸쳐 비교할 수 있으며 통계 분석의 힘을 증가시킵니다.
여기서는 TIRFM 라이브 셀 이미징이 모니터링하는 리소냐구획으로부터의 외세포증 이벤트의 공간 분포를 링 모양의 마이크로패턴-정규화 hTert-RPE1 세포에서 연구하기 위해 다양한 통계 도구를 사용합니다. 리소좀으로부터의 분비액은 무작위 과정이아님을확인하였고,,외세포증 이벤트는 클러스터링을 나타낸다. 참고로, 우리는 외세포증 사건이 또한 미각 부위에 클러스터되어 있다는 것을 것을을 발견했습니다, 접착 분자가 플라즈마 막에 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조물이 아니라는 것을 표시하. 그럼에도 불구하고 세포 접착력은 클러스터링을 향상시켰습니다. 일관되게, 우리의 분석은 접착제와 nonadhesive 지역 사이 국경에 있는 외세포증의 풍부한 지역을 확인했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 반지 모양의 마이크로패턴 정규화 된 세포에서 VAMP7-pHluorin의 TIRFM 라이브 셀 이미징에 의해 리소소말 구획에서 외세포증 이벤트를 모니터링하고 외세포증 이벤트의 공간 매개 변수에 대한 엄격한 통계 분석을 수행했습니다. 변형된 리플리의 K 기능과 가장 가까운 이웃 거리에 따른 통계 시험을 통해 리소좀으로부터의 분비가 무작위 공정8,,9가아…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 크게 VAMP7-pHluorin 플라스미드를 제공하는 티에리 갈리 (정신과 및 신경 과학센터, INSERM)를 인정합니다. 통계 분석과 GOUD 연구소 회원에 대한 조언을 구하여 유익한 토론을 해주신 것에 감사드립니다. 저자는 크게 세포 및 조직 이미징 시설 인정 (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg 및 PICT-IBiSA @Pasteur) 및 니콘 이미징 센터, Institut Curie (파리), 프랑스 국립 연구 인프라 프랑스 -BioImaging의 회원 프랑스 -BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L.은 협회부어 라 레체쉬 르 암 (ARC)에 의해 지원되었고 P.M.은 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 No 666003에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 지원받았습니다. 이 작품은 감염 ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), 라벡스 셀티스피비오 (ANR-10-LBX-0038) 및 이덱스 파리 과학 에 레트레스 (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)뿐만 아니라 센터 국립 디 라 리피티크에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
References
- Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion “Hotspots” Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. . Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
