قياس المعلمات االوقائية من إكسوسيتسيس الخلوية في الخلايا micropatterned
Summary
التصوير الحي للزخات الليفية على الخلايا الصغيرة يسمح لك بالكمية المكانية لهذه العملية. التطبيع مورفولوجيا باستخدام micropatterns هو أداة متميزة للكشف عن القواعد العامة حول التوزيع المكاني للعمليات الخلوية.
Abstract
التصوير الحي للpHluorin الموسومة القابلة للذوبان N-ethylmaleimide الحساسة عامل ملحق البروتين REceptor (V-SNARE) بروتين الغشاء المرتبط Vesicle 7 (VAMP7) عن طريق مجموع المجهر الفلورية الداخلية الانعكاس (TIRFM) هو وسيلة مباشرة لاستكشاف إفراز من المقصورة lysosomal. الاستفادة من ثقافة الخلية على الأسطح micropatterned لتطبيع شكل الخلية، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأدوات الإحصائية لإجراء تحليل مكاني للأنماط الإفرازية. باستخدام وظيفة ريبلي K واختبار إحصائي يستند إلى أقرب مسافة الجيران (NND)، أكدنا أن إفراز من lysosomes ليست عملية عشوائية ولكن يظهر التجمع كبيرة. ملاحظة, تحليلنا كشفت أن الأحداث exocytosis هي أيضا مجمعة في المناطق غير الالتصاق, مشيرا إلى أن جزيئات الالتصاق ليست الهياكل الوحيدة التي يمكن أن تحفز بؤر ساخنة إفرازية في غشاء البلازما. ومع ذلك، وجدنا أن التصاق الخلية يعزز التجمع. بالإضافة إلى المناطق اللاصقة وغير اللاصقة المحددة بدقة ، فإن الهندسة الدائرية لهذه الميكوروبات يسمح باستخدام الإحداثيات القطبية ، وتبسيط التحليلات. استخدمنا تقدير كثافة النواة (KDE) ووظيفة التوزيع التراكمية على الإحداثيات القطبية لأحداث الإزدِاد لتحديد المناطق الغنية من الزّب. وفي الخلايا الصغيرة ذات الشكل الحلقي، حدث التجميع عند الحدود بين المناطق اللاصقة وغير اللاصقة. ويوضح تحليلنا كيف يمكن استخدام الأدوات الإحصائية لدراسة التوزيعات المكانية للعمليات البيولوجية المتنوعة.
Introduction
إكسوسيتوزيس هو عملية الخلوية العالمية التي الصمامات في vesicle مع غشاء البلازما وتطلق محتواها. يمكن للفتح إما أن يصهر تماما مع غشاء البلازما (الانصهار الكامل) أو إنشاء المسام الانصهار التي تبقى مفتوحة خلال فترة زمنية محدودة (قبلة وتشغيل)1. على سبيل المثال، يتم إطلاق البروتينات المركبة حديثاً في الوسط خارج الخلية من الفُيْنَسَة التي تأتي من مجمع غولجي. هذا المسار البيولوجي، anterograde هو بدائي، وخاصة في الكائنات الحية متعددة الخلايا، لافراز الببتيدات إشارة (على سبيل المثال، الهرمونات، الناقلات العصبية) ومكونات مصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال، الكولاجين)، وكذلك إلى نقل البروتينات عبر الغشاء إلى غشاء البلازما. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحدث إفرازات من إندوسومات مختلفة: 1) إعادة تدوير الغدد الوسومات من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الميمبرين؛ 1) إعادة تدوير الغدد الانسهازومات من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الغشاء؛ 1) إعادة تدوير الغدد الانسهازية من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الغشاء؛ (1) إعادة تدوير الغدد الانسهازية من أجل إعادة استخدام البروتين 2) الهيئات متعددة الأطراف (MVBs) لإطلاق الكوسومات؛ و 3) lysosomes للافراج عن الانزيمات البروتية. وقد تبين إفراز الغدد النابعة لتكون مهمة لthgrowth نيوريت، تشكيل pseudopodia، وإصلاح غشاء البلازما، وإشارات ATP تعتمد2.
لدراسة الزخراب على مستوى الخلية الواحدة، تم استخدام العديد من التقنيات. التصحيح المشبك يسمح للكشف عن أحداث اكسوسيتوزيس واحد مع دقة زمنية عالية في مجموعة واسعة من الخلايا الحية3. ومع ذلك، لا يوفر هذا الأسلوب معلومات حول ترجمة أحداث القذف، ولا من أي المقصورة يحدث. يسمح المجهر الإلكتروني بالتصور المباشر للأحداث واظهارية مع دقة مكانية عالية، وبالاقتران مع علم المناعة يوفر معلومات حول خصوصية المقصورات والجزيئات المعنية. ومن عيوب هذا النهج نقص المعلومات عن ديناميات العملية، فضلا عن عدم قدرتها على إجراء دراسات عالية الإنتاجية. 24- توفر أساليب التحليل المجهري الخفيف مثل التحليل المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM)، الذي يستغل الحقل المضيء لإلقاء الضوء على الفلوروفور في محيط الغطاء (100 نانومتر)، دقة زمنية ومكانية جيدة لدراسة أحداث القذف. ومع ذلك، هذه الطريقة متوافقة فقط مع الخلايا المتصّقة ولا يمكن تطبيقها إلا على الجزء البطني/السفلي من الخلايا.
لاحظ أن غشاء البلازما يكشف عن عدم تجانس كبير على أساس مجمعات لاصقة موجودة فقط في المناطق المحظورة. هذا التغاير يقيد، على سبيل المثال، امتصاص حروف رابطة مختلفة4. وبالمثل، فقد أفيد مؤخرا أن إفراز مجمع غولجي يتركز في “النقاط الساخنة” في غشاء البلازما5. وعلاوة على ذلك، فمن المعروف أن بعض البضائع تفرز من خلال التركيز التصاق المرتبطة exocytosis6. وهكذا، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لمسألة ما إذا كانت الأحداث exocytosis توزع عشوائيا في الفضاء، أو ما إذا كانت تتركز في مناطق محددة من غشاء البلازما. وقد اقترحت العديد من الأدوات الإحصائية على أساس وظيفة سبيلي K لاستكشاف هذه الأسئلة7،8،9. نهجنا يجمع بين هذه الأدوات مع micropatterning للسيطرة على شكل الخلية وغشاء البلازما غير متجانسة. بالإضافة إلى توفير وسيلة للتمييز بين المناطق اللاصقة وغير اللاصقة ، تسمح هذه التقنية أيضًا بالمقارنة عبر الخلايا والظروف المختلفة وتزيد من قوة التحليلات الإحصائية.
هنا نوظف مجموعة متنوعة من الأدوات الإحصائية لدراسة التوزيع المكاني لأحداث القذف من المقصورة الليسوسومية التي رصدها TIRFM التصوير الخلية الحية من VAMP7-pHluorin في شكل رنين micropattern تطبيع hTert-RPE1 الخلايا. وقد تأكد أن إفراز من lysosomes ليست عملية عشوائية8,9 وأن الأحداث exocytosis المعرض التجمع. ملاحظة, وجدنا أن الأحداث exocytosis هي أيضا مجمعة في المناطق غير التصانية, مشيرا إلى أن جزيئات الالتصاق ليست الهياكل الوحيدة التي يمكن أن تحفز النقاط الساخنة الإفرازية في غشاء البلازما. ومع ذلك، فإن التصاق الخلية عزز التجمع. على الدوام، حدد تحليلنا المناطق المخصبة من الزخرفة التي كانت تقع على الحدود بين المناطق اللاصقة وغير الالتصاقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
رصدنا أحداث الزخراب من المقصورة الليسوسومية من قبل TIRFM تصوير الخلايا الحية من VAMP7-pHluorin في خلايا ميكروباتترن على شكل حلقة وأجرى تحليلا إحصائيا دقيقا للبارامترات المكانية لأحداث الزبيب. توظيف وظيفة K ريبلي تحولت واختبار إحصائي على أساس أقرب مسافة الجار، وأكدنا أن إفراز من lysosomes ليست عملية ع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف كثيرا تييري غالي (مركز الطب النفسي وعلم الأعصاب، INSERM) لتوفير VAMP7-pHluorin plasmid. نشكر تارن دوونغ على المشورة بشأن التحليل الإحصائي وأعضاء مختبر GOUD لإجراء مناقشات مثمرة. الكتاب الاعتراف كثيرا الخلية والأنسجة التصوير مرفق (PICT – IBiSA @Burg ، PICT – EM @Burg وPICT – IBiSA @Pasteur) ونيكون مركز التصوير ، معهد كوري (باريس) ، عضو في فرنسا الفرنسية الوطنية للبحوث البنية التحتية – BioImaging (ANR10 – INBS – 04). وقد تلقت هـ.ل. الدعم من رابطة ابحاث السرطان (ARC) وتلقت P.M. التمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie No 666003. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04)، وSlabex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038 ) وريديكس باريس للعلوم ولتريس (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)، وكذلك المركز الوطني لريشيرتشي ساينتفيك ومعهد كوري.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
References
- Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion “Hotspots” Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. . Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
