微小パターン化細胞における細胞興奮性の時空間的パラメータの定量
Summary
微小パターン化細胞上のリソソームエキサイトーシスのライブイメージングは、このプロセスの空間的定量化を可能にする。マイクロパターンを用いたモルフォロジーの正規化は、細胞プロセスの空間分布に関する一般的なルールを明らかにする優れたツールです。
Abstract
pHluorinタグ付き可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質REceptor(v-SNARE)ベシクル関連膜タンパク質7(VAMP7)の生画像化は、全内部反射蛍光顕微鏡(TIRFM)によるリソマルコンパートメントからの分泌を探索する簡単な方法である。微小パターン化された表面での細胞培養を利用して細胞形状を正常化し、分泌パターンの空間解析を行う様々な統計ツールを用いた。RipleyのK関数と近傍距離(NND)に基づく統計的検定を用いて、リソソームからの分泌はランダムなプロセスではなく、有意なクラスタリングを示していることを確認した。なお、我々の分析は、エキソサイトーシス事象が非接着領域にも集まっていることを明らかにし、接着分子が形質膜で分泌ホットスポットを誘導できる唯一の構造ではないことを示した。それでも、細胞接着はクラスタリングを強化することがわかりました。これらのマイクロパターンの円形ジオメトリは、接着領域と非接着領域を正確に定義したほか、極座標を使用して解析を簡素化します。我々は、Exocitosisイベントの極座標に対するカーネル密度推定(KDE)および累積分布関数を用いて、興奮性細胞化の豊かな領域を同定した。リング状のマイクロパターンセルでは、接着領域と非接着領域の境界でクラスタリングが行われた。我々の分析は、統計的ツールを使用して多様な生物学的プロセスの空間分布を調査する方法を示しています。
Introduction
エキソサイトーシスは、小胞が血漿膜と融合し、その内容を放出する普遍的な細胞プロセスである。小胞は、完全に血漿膜(完全な融合)と融合するか、限られた時間(キスアンドラン)1の間に開いたままの融合細孔を作成することができます。例えば、新たに合成されたタンパク質は、ゴルジ複合体から来る小胞から細胞外媒体に放出される。この生合成、前向きの経路は、原始であり、特に多細胞生物において、シグナル伝達ペプチド(例えば、ホルモン、神経伝達物質)および細胞外マトリックス成分(例えば、コラーゲン)を分泌すること、ならびに膜貫通タンパク質を細胞膜に通行させる。さらに、分泌物は異なるエンドーソームから起こり得る:1)膜貫通タンパク質を再利用するために、エンドーソームをリサイクルする。2)エキソソームを放出する多面体(MVB)。3)タンパク質分解酵素の放出のためのリソソーム。内膜分泌は、神経突起の成長、疑似ポディア形成、血漿膜修復、およびATP依存性シグナル伝達2にとって重要であることが示されている。
単細胞レベルでの興奮性の研究のために、いくつかの技術が採用されている。パッチクランプは、多種多様な生細胞3で高い時間分解能を持つ単一の興奮性イベントの検出を可能にする。ただし、このメソッドは、exocytosis イベントのローカライズに関する情報も、どのコンパートメントから発生するのかを提供しません。電子顕微鏡法は、高い空間分解能を持つexocyticイベントを直接可視化することを可能にし、免疫標識と組み合わせて、関係するコンパートメントおよび分子の特異性に関する情報を提供する。このアプローチの欠点は、プロセスのダイナミクスに関する情報の欠如と、ハイスループットの調査を実行できないことです。全内部反射蛍光顕微鏡(TIRFM)のような光顕微鏡法は、エバネッセントフィールドを利用してカバースリップ付近(100nm)の蛍光体を照射し、エキソサイトーシス事象を研究するための良好な時間的および空間的分解能を提供する。しかし、この方法は接着細胞とのみ互換性があり、細胞の腹側/劣った部分にのみ適用できます。
注目に、原形質膜は、制限された領域にのみ存在する接着複合体に基づいて有意な不均一性を明らかにする。この異質性は、例えば、異なるリガンド4の取り込みを制限する。同様に、最近、ゴルジ複合体からの分泌が、形質膜5の「ホットスポット」に集中することが報告されている。さらに、特定の貨物が焦点接着関連のエキソサイトーシス6によって分泌されるということが知られている。したがって、エキソサイトーシスイベントが空間内にランダムに分布しているのか、あるいはそれらが形質膜の特定の領域に集中しているのかという問題に特に注意する必要があります。リプリーのK関数に基づくいくつかの統計ツールは、これらの質問77、8、98,9を探求するために提案されています。当社のアプローチは、これらのツールをマイクロパターニングと組み合わせて、細胞形状および形質膜の不均一性を制御します。接着領域と非接着領域を区別する手段を提供することに加えて、この技術は異なる細胞および条件間の比較を可能にし、統計的分析の力を高める。
ここでは、リング状の微小パターン正規化hTert-RPE1細胞におけるVAMP7-pHluorinのTIRFMライブ細胞イメージングによって監視されるリソソームコンパートメントからのエキソサイトーシスイベントの空間分布を研究するために、さまざまな統計学的ツールを用います。リソソームからの分泌はランダムなプロセス88,9ではなく、9エキソサイトーシスイベントがクラスタリングを示すことを確認した。なお、エキソサイトーシスの事象は非接着領域にも集まっており、接着分子が、形質膜で分泌ホットスポットを誘導できる唯一の構造ではないことを示している。それにもかかわらず、細胞接着はクラスタリングを増強した。一貫して、我々の分析は、接着剤と非接着領域の境界に位置する興奮性の豊かな領域を同定した。
Protocol
Representative Results
Discussion
リング状の微小パターン正規化細胞におけるVAMP7-pHluorinのTIRFM生細胞イメージングによるリソソームコンパートメントからのエキソサイトーシスイベントをモニタリングし、エキソサイトーシスイベントの空間パラメータの厳密な統計解析を行った。変換されたリプリーのK関数と最も近い近傍距離に基づく統計的検定を採用し、リソソームからの分泌はランダムなプロセス8<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、VAMP7-pHluorinプラスミドを提供したティエリー・ガリ(精神医学・神経科学センター、INSERM)を大いに認める。統計分析に関するアドバイスとGOUD研究所のメンバーに対して、実りある議論を行なったTarn Duongに感謝します。著者らは、細胞・組織イメージング施設(PICT-IBiSA@Burg、PICT-EM@Burg、PICT-IBiSA@Pasteur)と、フランス国立研究インフラフランスバイオイメージング(ANR10-INBS-04)のメンバーであるニコンイメージングセンター、インスティトゥートキュリー(パリ)を大いに認めている。H.L.は、協会がラ・レシェルシュ・シュル・ル・ガン(ARC)を注ぎ、P.M.はマリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金第666003年に基づく欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから資金を受け取りました。この研究は、感染ERA(ANR-14-IFEC-0002-04)、ラベックス・セルティスフィバイオ(ANR-10-LBX-0038)、アイデックス・パリ・サイエンシズ・エ・レットレス(ANR-10-IDEX-0001-0001-02 PSL)、およびセンター・ナショナル・ド・ラ・レンチェルチェ・シビッテ・シヴィティー・シヴィティー・シヴィティー・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィット・シヴィット・アンド・イチビティ・ナショナル・ナショナル・デ・ラ・リチェルチェ・シビフィー・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シビティー・アンド・イン・シビティー・ナショナル・ナショナル・ド・ラ・リチェルチェリ・シビッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シビティー
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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