Summary

Aislamiento concomitante de astrocitos primarios y microglia para la infección por parásitos protozoos

Published: March 18, 2020
doi:

Summary

El objetivo general de este protocolo es instruir cómo extraer, mantener y disociar las células de astrocitos murinoy y microglia del sistema nervioso central, seguida de una infección con parásitos protozoos.

Abstract

Los astrocitos y la microglia son las células gliales más abundantes. Son responsables del apoyo fisiológico y el mantenimiento de la homeostasis en el sistema nervioso central (SNC). Las crecientes evidencias de su participación en el control de enfermedades infecciosas justifican el interés emergente en la mejora de metodologías para aislar los astrocitos primarios y la microglia con el fin de evaluar sus respuestas a las infecciones que afectan al SNC. Teniendo en cuenta el impacto de la infección Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y Toxoplasma gondii (T. gondii) en el SNC, aquí proporcionamos un método para extraer, mantener, disociar e infectar astrocitos murinos y células microglia con parásitos protozoos. Las células extraídas de cortices recién nacidos se mantienen in vitro durante 14 días con reemplazo diferencial periódico de medios. Los astrocitos y la microglia se obtienen del mismo protocolo de extracción por disociación mecánica. Después de fenotiar por citometría de flujo, las células se infectan con parásitos protozoos. La tasa de infección se determina mediante microscopía de fluorescencia en diferentes momentos, lo que permite la evaluación de la capacidad diferencial de las células gliales para controlar la invasión y replicación protozoaria. Estas técnicas representan métodos simples, baratos y eficientes para estudiar las respuestas de los astrocitos y la microglia a las infecciones, abriendo el campo para un análisis de neuroinmunología.

Introduction

El SNC se compone principalmente de neuronas y células gliales1,2,3. La microglia y los astrocitos son las células glias más abundantes del SNC. Microglia, el macrófago residente, es el inmunocompetente y la célula glia fagocítica en el SNC3,4, mientras que los astrocitos son responsables de mantener la homeostasis y ejercer funciones de apoyo5.

A pesar de que las células gliales son clásicamente conocidos por ser responsables del apoyo y la protección de las neuronas6,7, las funciones emergentes de estas células se han descrito en la literatura reciente, incluyendo sus respuestas a las infecciones8,9,10,11. Por lo tanto, hay un empujón para desarrollar métodos para aislar estas células gliales para entender sus funciones individualmente.

Existen algunos modelos alternativos para estudiar células gliales en lugar de cultivos primarios, como linajes celulares inmortalizados y modelos in vivo. Sin embargo, las células inmortalizadas son más propensas a sufrir cambios genéticos y morfológicos, mientras que los estudios in vivo imponen condiciones de manipulación limitadas. Por el contrario, los cultivos primarios son fáciles de manejar, se asemejan mejor a las células in vivo y también nos permiten controlar los factores experimentales12,,13. Aquí, describimos pautas sobre cómo extraer, mantener y disociar astrocitos murinos y células primarias de microglia en el mismo protocolo. Además, también proporcionamos ejemplos sobre cómo trabajar con la infección protozoa en estos cultivos.

Las células del SNC extraídas de ratones neonatales (hasta 3 días de edad) se cultivaron durante 14 días en medios diferenciales que permiten el crecimiento preferencial de astrocitos y células de microglia. Dado que la microglia descansa por encima de los astrocitos adjuntos, las poblaciones celulares se disociaron mecánicamente en una incubadora orbital. A continuación, recogimos todo el sobrenadante que contiene microglia y añadimos trippsina para separar los astrocitos. Las células gliales aisladas fueron evaluadas fenotípicamente por citometría de flujo y chapadas de acuerdo con el experimento deseado.

También proporcionamos ejemplos sobre cómo infectar a estas microglias aisladas y astrocitos con parásitos protozoos. T. gondii es un protozoo altamente neurotrópico responsable de la toxoplasmosis14,mientras que T. cruzi es responsable de la enfermedad de Chagas que puede conduce al desarrollo de trastornos neurológicos en el SNC15,,16. Además, también se ha informado de que la infección por T. gondii17,18 o T. cruzi19,20,21 fueron la causa presumible de muerte en pacientes inmunocomprometidos. Por lo tanto, el esclarecimiento del papel inmunológico de las células gliales del SNC en el control de las infecciones protozoarias es de gran importancia.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales relacionados con ratones fueron llevados a cabo de acuerdo con la Ley Nacional de Brasil (11.794/2008) y aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad Federal de Sao Paulo (UNIFESP). 1. Extracción, Mantenimiento y Disociación de Células Glial NOTA: El número de ratones utilizados para la extracción de células gliales depende de la cantidad de células necesarias para realizar …

Representative Results

En eldía 14, el cultivo de células gliales(Figura 1A)sufrió disociación mecánica. Las poblaciones de células aisladas fueron analizadas por citometría de flujo según los marcadores CD11b, CD45 y GFAP. Podríamos observar una pureza del 89,5% para la población de astrocitos y del 96,6% para la población de microglia(Figura 1B). Después del aislamiento, las células fueron chapadas en una placa plana de 96 po…

Discussion

La importancia de estudiar las funciones aisladas de las células gliales en contextos biológicos distintos se ha ido ampliando en las últimas dos décadas. Comprender el SNC más allá de las neuronas sigue siendo un campo creciente en la biología celular, especialmente en infecciones o condiciones inflamatorias8,9,24. Las células gliales son cruciales no sólo para el soporte físico de las neuronas (como se conocía anter…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias al profesor Dr. Renato A. Mortara, de la Universidad Federal de Sao Paulo (UNIFESP), por mAb 2C2 anti-Ssp-4. Esta obra fue apoyada por subvenciones de la Fundación de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, subvención 2017/25942-0 a K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 402100/2016-6 a K.R.B., Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de Vacinas (INCTV/CNPq) y Coordena-o de Aperfei-oamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código De Finanzas 001). M.P.A. recibe beca de CNPq, A.L.O.P. recibe beca de CAPES, e I.S.F y L.Z.M.F.B. reciben beca de FAPESP.

Materials

70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 mm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat – anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS – Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10X) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 ºC with trypsin

References

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Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

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