Summary

Isolement concomitant des astrocytes primaires et des microglies pour l’infection de parasite de Protozoa

Published: March 18, 2020
doi:

Summary

L’objectif global de ce protocole est d’instruire comment extraire, maintenir et dissocier les cellules astrocytes murines et microglies du système nerveux central, suivies d’une infection par des parasites protozoaires.

Abstract

Les astrocytes et les microglies sont les cellules gliales les plus abondantes. Ils sont responsables du soutien physiologique et de l’entretien de l’homéostasie dans le système nerveux central (SNC). Les preuves croissantes de leur participation à la lutte contre les maladies infectieuses justifient l’intérêt croissant pour l’amélioration des méthodologies pour isoler les astrocytes primaires et les microglies afin d’évaluer leurs réponses aux infections qui affectent le SNC. Considérant l’impact de Trypanosoma cruzi (T. cruzi) et Toxoplasma gondii (T. gondii) infection dans le SNC, ici nous fournissons une méthode pour extraire, maintenir, dissocier et infecter les astrocytes murins et les cellules de microglie avec des parasites protozoaires. Les cellules extraites des cortices nouveau-nés sont maintenues in vitro pendant 14 jours avec le remplacement différentiel périodique de médias. Les astrocytes et les microglies sont obtenus à partir du même protocole d’extraction par dissociation mécanique. Après le phénotypage par cytométrie d’écoulement, les cellules sont infectées par des parasites de protozoaire. Le taux d’infection est déterminé par la microscopie de fluorescence à différents moments, permettant ainsi l’évaluation de la capacité différentielle des cellules gliales pour commander l’invasion et la réplication protozoaires. Ces techniques représentent des méthodes simples, bon marché et efficaces pour étudier les réponses des astrocytes et des microglies aux infections, ouvrant le champ à d’autres analyses neuroimmunologiques.

Introduction

Le CNS est principalement composé de neurones et de cellules gliales1,2,3. Les microglies et les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du SNC. Microglia, le macrophage résident, est l’immunocompétence et la cellule gliale phagocytique dans le CNS3,4, tandis que les astrocytes sont responsables du maintien de l’homéostasie et exercent des fonctions de soutien5.

En dépit des cellules gliales étant classiquement connues pour être responsables du soutien et de la protection des neurones6,7, les fonctions émergentes de ces cellules ont été décrites dans la littérature récente, y compris leurs réponses aux infections8,9,10,11. Ainsi, il ya une poussée pour développer des méthodes pour isoler ces cellules gliales pour comprendre leurs fonctions individuellement.

Il existe d’autres modèles pour étudier les cellules gliales plutôt que les cultures primaires, comme les lignées cellulaires immortalisées et les modèles in vivo. Cependant, les cellules immortalisées sont plus susceptibles de subir des changements génétiques à la dérive et morphologiques, tandis que les études in vivo imposent des conditions de manipulation limitées. Inversement, les cultures primaires sont faciles à manipuler, mieux ressembler aux cellules in vivo et nous permettent également de contrôler les facteurs expérimentaux12,13. Ici, nous décrivons des lignes directrices sur la façon d’extraire, maintenir et dissocier les astrocytes murins et les cellules primaires de microglie dans le même protocole. En outre, nous fournissons également des exemples sur la façon de travailler avec l’infection à protozoaires dans ces cultures.

Les cellules du SNC extraites de souris néonatales (jusqu’à 3 jours) ont été cultivées pendant 14 jours sur des supports différentiels qui permettent la croissance préférentielle des astrocytes et des cellules de microglies. Puisque les microglies reposent au-dessus des astrocytes attachés, les populations cellulaires ont été mécaniquement dissociées dans un incubateur orbital. Ensuite, nous avons recueilli tous les supernatants contenant des microglies et ajouté de la trypsine pour détacher les astrocytes. Les cellules gliales isolées ont été évaluées phénotypiquement par cytométrie d’écoulement et plaquées selon l’expérience désirée.

Nous avons également fourni des exemples sur la façon d’infecter ces microglies et astrocytes isolés avec des parasites protozoaires. T. gondii est un protozoaire hautement neurotrope responsable de la toxoplasmose14, tandis que T. cruzi est responsable de la maladie de Chagas qui peut conduit au développement de troubles neurologiques dans leSNC 15,16. En outre, il a également été signalé que l’infection par T. gondii17,18 ou T. cruzi19,20,21 étaient la cause vraisemblablement de la mort chez les patients immunocompromisés. Par conséquent, l’élucidation du rôle immunologique des cellules gliales du SNC dans le contrôle des infections de protozoaire est d’une grande importance.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales impliquant des souris ont été effectuées conformément à la loi nationale brésilienne (11.794/2008) et approuvées par les Comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université fédérale de Sao Paulo (UNIFESP). 1. Extraction, entretien et dissociation des cellules gliales REMARQUE : Le nombre de souris utilisées pour l’extraction des cellules gliales dépend de la quantité de cellul…

Representative Results

Le 14e jour, la culture des cellules gliales(figure 1A) a subi une dissociation mécanique. Les populations cellulaires isolées ont été analysées par cytométrie d’écoulement selon les marqueurs CD11b, CD45 et GFAP. Nous avons pu observer une pureté de 89,5% pour la population d’astrocytes et de 96,6% pour la population de microglies(figure 1B). Après l’isolement, les cellules ont été plaquées dans une…

Discussion

L’importance d’étudier les fonctions isolées des cellules gliales dans des contextes biologiques distincts s’est développée au cours des deux dernières décennies. Comprendre le SNC au-delà des neurones est encore un domaine croissant dans la biologie cellulaire, en particulier dans les infections ou les conditions inflammatoires8,9,24. Les cellules glials sont cruciales non seulement pour le soutien physique des neu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier le professeur Renato A. Mortara de l’Université fédérale de Sao Paulo (UNIFESP) pour mAb 2C2 anti-Ssp-4. Ce travail a été soutenu par des subventions de Fundaço de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, subvention 2017/25942-0 à K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient-fico e Tecnol-ogico (CNPq, 402100/2016-6 à K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) et Coordenaçao de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nàvel Superior (CAPES, Code financier 001). M.P.A. reçoit une bourse du CNPq, A.L.O.P. reçoit une bourse de CAPES, et I.S.F et L.Z.M.F.B. reçoivent une bourse de la FAPESP.

Materials

70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 mm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat – anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS – Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10X) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 ºC with trypsin

References

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Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

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