בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל
Summary
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להנחות כיצד לחלץ, לתחזק, ו הנתק מורטין אסטרוציט ו מיקרוגליה תאים ממערכת העצבים המרכזית, ואחריו זיהום עם טפילים פרוטותים.
Abstract
Astrocytes ו מיקרוגלייה הם התאים השופעים ביותר גליה. הם אחראים על תמיכה פיזיולוגית והומאוסטזיס תחזוקה במערכת העצבים המרכזית (CN). העדויות הגדלות של מעורבות שלהם בשליטה של מחלות זיהומיות להצדיק את העניין המתעוררים לשיפור של מתודולוגיות כדי לבודד אסטרוציטים הראשי מיקרוגליה כדי להעריך את התגובות שלהם זיהומים המשפיעים על ה-cn. בהתחשב ההשפעה של טריאנוסומה cruzi (t. cruzi) ו טוקסופלזמה gondii (t. gondii) זיהום ב-cn, כאן אנו מספקים שיטה לחלץ, לתחזק, לנתק ולהדביק murine האסטרוציטים ותאים מיקרוגלייה עם טפילים פרוטותים. תאים שחולצו מתוך היילוד מתוחזקות בתוך מבחנה 14 ימים עם החלפת מדיה דיפרנציאלית תקופתית. Astrocytes ו מיקרוגלייה מתקבלים באותו פרוטוקול החילוץ על ידי דיסוציאציה מכנית. לאחר פנוטיפים על ידי הזרימה cy, לנסות, תאים נגועים בטפילים פרוטותים. שיעור הזיהום נקבע על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית בנקודות זמן שונות, ובכך מאפשר הערכה של היכולת הדיפרנציאלית של תאי גליה כדי לשלוט על הפלישה פרוטוזוא ושכפול. טכניקות אלה מייצגות פשוטה, שיטות זולות ויעילות כדי ללמוד את התגובות של אסטרוציטים ו מיקרוגלייה לזיהומים, פתיחת השדה עבור ניתוח נוירואימונולוגיה נוספת.
Introduction
ה-cn מורכב בעיקר מנוירונים ותאי גלאל1,2,3. Microglia ו אסטרוציטים הם התאים הנפוצים ביותר של גליה ב-cn. Microglia, מקרופאג תושב, הוא החיסוני ואת התאים של הphagocytic ב-cn3,4, בעוד אסטרוציטים אחראים לשמירה על הומאוסטזיס ולהפעיל פונקציות תומכות5.
למרות התאים גליה הידוע באופן קלאסי להיות אחראי על תמיכה והגנה של נוירונים6,7, פונקציות המתעוררים של תאים אלה תוארו בספרות האחרונות, כולל התגובות שלהם זיהומים8,9,10,11. כך, יש דחיפה לפתח שיטות כדי לבודד אלה התאים גליה כדי להבין את הפונקציות שלהם בנפרד.
יש כמה דגמים חלופיים כדי ללמוד תאים גליה ולא התרבויות הראשיות, כמו לספירת תאים מונצח ומודלים vivo. עם זאת, תאים מונצח נוטים יותר לעבור שינויים גנטיים נסחף מורפולוגיים, בעוד במחקרים vivo להטיל תנאים מניפולציה מוגבלת. לעומת זאת, התרבויות הראשיות קל לטפל, טוב יותר להידמות vivo תאים וגם לאפשר לנו לשלוט גורמים ניסיוניים12,13. כאן, אנו לתאר הנחיות על איך לחלץ, לשמור ולנתק את מורטין אסטרוציטים ואת התאים הראשוניים מיקרוגלייה באותו פרוטוקול. יתרה מזאת, אנו גם מספקים דוגמאות לעבודה עם זיהום פרוטותים בתרבויות אלה.
תאי ה-cn שחולצו מעכברים הנמצאים במצב של עד 3 ימים, היו מתורבתים במשך 14 יום על מדיה דיפרנציאלית המאפשרת צמיחה מועדפים של התאים ה אסטרוציטים ו מיקרוגלייה. מאז השאר מיקרוגלייה מעל האסטרוציטים המצורפת, אוכלוסיות תאים היו מונתק מכנית בחממה מסלולית. לאחר מכן, אספנו את כל הסופרנטנט המכיל מיקרוגלייה וטריפסין שנוספו לניתוק האסטרוציטים. תאים גליה מבודדים היו פנופנזה בדרך כלל הוערך על ידי cy, לנסות ומצופה על פי הניסוי הרצוי.
כמו כן סיפקנו דוגמאות על איך להדביק אלה מיקרוגלייה מבודדים ו אסטרוציטים עם טפילים פרוטותים. T. gondii הוא מאוד נוירוטרופי פרוטומי אחראי לטוקסופלזמוזיס14, בעוד T. cruzאני אחראי על מחלת הצ אשר יכול להיות מוביל להתפתחות של הפרעות נוירולוגיות בתוך המוח15,16. יתר על כן, זה גם דווח כי זיהום עם T. gondii17,18 או T. cruzi19,20,21 היו הגורם אני של מוות בחולים בסיכון חיסוני. לכן, ההסבר של התפקיד החיסוני של התאים גליה מתוך ה-cn בשליטה בזיהומים פרוטותים הוא בעל חשיבות רבה.
Protocol
Representative Results
Discussion
החשיבות של לימוד תאים גליאל מבודדים פונקציות בהקשרים ביולוגיים נפרדים התרחב בשני העשורים האחרונים. הבנה מעבר לנוירונים הוא עדיין תחום הולך וגדל בביולוגיה של התא, במיוחד תחת זיהומים או מצבים דלקתיים8,9,24. התאים glial חיוניים לא רק עבור הנויר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
היינו רוצים להודות לפרופסור ד ר רנאטו A. Mortara מהאוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו (UNIFESP) עבור mAb 2C2 אנטי-Ssp-4. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מפונדסאו דה Amparo à Pesquisa do Estado דה סאו פאולו (FAPESP, להעניק 2017/25942-0 ל K.R.B.), Conselho הלאומי דה Desenvolvimento Cientfico e Tecnológico (CNPq, להעניק 402100/2016-6 ל K.R.B.), המכון הלאומי לצ דה ווקאינאס דה ואקנאס (בטלוויזיה/CNPq) וכורדניצ דה אפרטפייטןדה פאויאל מעולה (שכמיות, מימון קוד 001). M.P.A. מקבל מלגת CNPq, A.L.O.P. מקבל האחווה מ שכמיות, ו-I. S. F ו L.Z.M.F.B. מקבל מלגת מ FAPESP.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
References
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
