Summary

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

Published: January 15, 2020
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Summary

Este protocolo descreve um processo experimental para produzir partículas pseudodigitadas virais infecciosas de alto titer (pp) com glicoproteínas envelope de duas cepas de gripe A e como determinar sua infectividade. Este protocolo é altamente adaptável para desenvolver pps de qualquer outro tipo de vírus envolvidos com glicoproteínas envelope diferentes.

Abstract

A transmissão direta ocasional do vírus altamente patogênico da gripe aviária A H5N1 (HPAI H5N1) e H7N9 aos seres humanos e sua letalidade são graves problemas de saúde pública e sugerem a possibilidade de uma epidemia. No entanto, nossa compreensão molecular do vírus é rudimentar, e é necessário estudar as propriedades biológicas de suas proteínas envelope como alvos terapêuticos e desenvolver estratégias para controlar a infecção. Desenvolvemos uma plataforma de partículas pseudodigitadas virais sólidas (pp) para estudar o vírus da gripe aviária, incluindo a análise funcional de sua hemaglutinina (HA) e glicoproteínas envelope de neuraminidase (NA), as características de ressortamento dos HAs e NAs, receptores, troposmas, anticorpos neutralizantes, diagnóstico, infectividade, para fins de desenvolvimento de medicamentos e projeto de vacinas. Aqui, descrevemos um procedimento experimental para estabelecer pps com o envelope glicoproteínas (HA, NA) a partir de duas cepas de gripe A (HAPI H5N1 e 2013 aviário H7N9). Sua geração é baseada na capacidade de alguns vírus, como o vírus da leucemia murina (MLV), para incorporar glicoproteínas envelope em um pp. Além disso, também detalhamos como esses pps são quantificados com RT-qPCR, e a detecção de infectividade de pps vírus nativos e incompatíveis, dependendo da origem dos HAs e NAs. Este sistema é altamente flexível e adaptável e pode ser usado para estabelecer pps virais com glicoproteínas envelope que podem ser incorporados em qualquer outro tipo de vírus envolto. Assim, esta plataforma de partículas virais pode ser usada para estudar vírus selvagens em muitas investigações de pesquisa.

Introduction

A missão de uma partícula viral é transportar seu genoma de uma célula hospedeira infectada para uma célula hospedeira não infectada e entregá-la ao citoplasma ou ao núcleo em umaforma1 competente para replicação. Este processo é inicialmente desencadeado pela ligação aos receptores celulares hospedeiros, seguido pela fusão de virion e membranas celulares. Para vírus envolvidos, como os vírus da gripe, as glicoproteínas de pico são responsáveis pela ligação do receptor e fusão1,2. Glicoproteínas envelope viral (por exemplo, pirogênios, antígenos), estão envolvidos em muitas propriedades e eventos importantes, tais como iniciação do ciclo de vida do vírus (ligação e fusão), patogênese viral, imunogenicidade, apoptose celular hospedeira e tropismo celular, a via endocítica celular, bem como a transmissão e reassortmentinterespécies 1,3,4,5,6,7. Pesquisa sobre glicoproteínas envelope viral nos ajudará a entender muitos aspectos do processo de infecção viral. Partículas virais pseudodigitadas (pp), também denominadas pseudovirions ou pseudopartículas, podem ser geradas através de uma técnica de pseudotipagem8,9,10. Esta tecnologia tem sido utilizada para desenvolver partículas pseudodigitadas de muitos vírus, incluindo hepatite C11,12,hepatite B13,vírus da estomatite vesicular (VSV)14,15,e vírus da gripe16,17,18,19. Esta tecnologia é baseada na proteína Gag-Pol de lentivírus ou outros retrovírus.

Partículas virais pseudodigitadas podem ser obtidas usando um sistema de três plasmídeos cotransfecting um plasmid de expressão de glicoproteína envelope viral, uma embalagem retroviral plasmid faltando o gene env envelope, e um plasmid repórter separado em células produtores pp. O retrovírus é montado por sua proteína Gag, e buds de uma membrana celular infectada que expressa o vírus envelope proteína1. Portanto, é possível obter pps de gripe de alto titer usando a proteína gag retrovírus para produzir botões em uma membrana celular expressando influenza HA e NA. Em nossos estudos anteriores, has/nas em todas as combinações foram funcionais e capazes de executar suas funções correspondentes no ciclo de vida viral16,17,18,20,21. Estes pps são usados para investigar características biológicas da gripe, incluindo a hemaglutinação, a atividade da neuraminidase, o tropismo obrigatório do HA-receptor, e a infectividade. Como ha e NA são proteínas funcionais de superfície importantes no ciclo de vida viral, HAs e NAs incompatíveis derivados de diferentes cepas de gripe podem demonstrar parcialmente a ressortição entre eles. Aqui, geramos oito tipos de influenza pps, combinando dois HAs e dois NAs (derivados da cepa HPAI H5N1 e da mancha H7N9), usando um sistema de pseudotipagem de três plasmídeos. Estes oito tipos de pps incluem dois pps nativos, H5N1pp, H7N9pp; dois pps incompatíveis, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; e quatro pps que abrigam apenas uma única glicoproteína (HA ou NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Estudos sobre o vírus influenza, como H5N1 e H7N9, são limitados por requisitos de biossegurança. Todos os estudos das cepas do vírus da gripe selvagem devem ser realizados em um laboratório de nível 3 de biossegurança (BSL-3). A tecnologia de partículas virais pseudodigitadas pode ser usada para empacotar um virion artificial em um ambiente de nível 2 de biossegurança (BSL-2). Portanto, pps representam uma ferramenta mais segura e útil para estudar os processos do vírus da gripe, dependendo de suas duas principais glicoproteínas: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA).

Este protocolo descreve a geração desses pps com uma estratégia de cotransfecção de três plasmid (vista geral na Figura 1),como quantificar pps e detecção de infectividade. A produção pp envolve três tipos de plasmídeos (Figura 1). O gene gag-pol, que codifica a proteína Gag-Pol retrovírus, foi clonado de um kit de embalagem retrovírus e inserido no plasmídeo pcDNA 3.1 e chamado pcDNA-Gag-Pol. O gene de proteína fluorescente verde melhorada (eGFP), que codifica a Proteína Fluorescente Verde, foi clonado do vetor pTRE-EGFP, inserido no plasmídeo pcDNA 3.1 e chamado pcDNA-GFP. Durante a clonagem, uma seqüência de sinal de embalagem () foi adicionada através de uma cartilha. Os genes HA e NA foram clonados em um plasmid pVRC, chamado pVRC-HA e pVRC-NA, respectivamente. O último plasmídeo codifica a proteína de fusão e pode ser substituído por qualquer outra proteína de fusão de interesse. Nossa plataforma de pseudotipagem inclui dois plasmídeos de expressão glicoproteína: pVRC-HA e pVRC-NA. Isso pode simplificar a pesquisa sobre a revariedadeção entre diferentes cepas de vírus em uma configuração BSL-2.

Protocol

1. Dia 1: Cultura celular e semeadura Cultivar células embrionárias embrionárias humanas (HEK) 293T/17 em pratos de 60 mm com o meio essencial modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 100 U/mL penicilina-estreptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) em uma incubadora de 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2)até cerca de 80% de confluentes.NOTA: Hek 293T/17 células de passagem baixa são recomendadas. Lave cuidadosamente as células com 5 mL de …

Representative Results

Dependendo do procedimento geral descrito acima, geramos 10 tipos de pps combinando dois has/nas de grupo ou glicoproteína VSV-G ou glicoproteínas sem envelope (mostrados na Tabela 1). Sete deles são infecciosos. Os pps que abrigam glicoproteína sem envelope ou apenas porto NA não mostrou qualquer infectividade aqui. O procedimento de produção de influenza pp é visto de forma geral na Figura 1. Micrografias eletrônicas de transmissão de pps (por exemplo, H5N1pp) s?…

Discussion

Neste protocolo, descrevemos um método para produzir partículas pseudodigitadas pelo vírus influenza (pp) em uma configuração BSL-2. O repórter plasmid pcDNA-GFP é incorporado aos pps e pode ser usado para quantificar pps pela FACS em um ensaio de infectividade. Escolhemos dois tipos de linhas celulares suscetíveis porque elas são amplamente utilizadas na pesquisa da gripe. As células MDCK forneceriam um bom controle para as células humanas imortalizadas variáveis usadas nesses estudos.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subvenções do Plano Provincial de Medicina e Ciência e Tecnologia da Saúde de Zhejiang (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science e Hangzhou Medical Science e Hangzhou Medical Science e Hangzhou Projeto chave de tecnologia (Grant Numbers, 2014Z11) e Hangzhou projeto municipal de aplicação autônoma de desenvolvimento social e pesquisa científica (Grant Numbers, 20191203B134).

Materials

Benzonase Nuclease Millipore 70664 Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) Corning 3599 Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) Costar 3516 Individual alphanumerical codes for well identification
Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM) Gibco 11965092 A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serum Excell FND500 fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Beckman coulter cytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells ATCC CRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells ATCC CRL-11268 A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscope Olympus BX51-32P01-FLB3
Inverted light microscope Olympus CKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019 Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit NEB E3006L Will withstand up to 14,000 RCF
RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells ATCC CCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Axygen MCT-150-C 33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF Millipore SLHV033RS an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 11058021 The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Maximum RCF is 12,500 xg
Temperature range from -80 °C to 120 °C
RNase-/DNase-free
Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL) Corning 430791 a stable and highly reactive serine protease
Proteinase K Beyotime ST532 Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm) Corning 430166 Trypsin from bovine pancreas
TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsin Sigma T1426 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056

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Zhang, F., Wang, Y., Shang, X., Wang, S., Xiao, R., Zhou, H., Cai, L. Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses. J. Vis. Exp. (155), e60663, doi:10.3791/60663 (2020).

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