고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산
Summary
이 프로토콜은 2개의 인플루엔자 A 긴장에서 봉투 당단백질을 가진 높은 역가 감염성 바이러스성 의사 입자 (pp)를 생성하는 실험 적인 프로세스및 그들의 감염성을 결정하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 봉투 당단백질을 가진 봉투바이러스의 그밖 모형의 pps를 개발하기 위하여 높게 적응합니다.
Abstract
고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 H5N1(HPAI H5N1) 및 H7N9를 인간에게 직접 적으로 전달하는 것은 심각한 공중 보건 문제이며 전염병의 가능성을 시사한다. 그러나, 바이러스의 우리의 분자 이해는 기초적이고, 그것의 봉투 단백질의 생물학 속성을 치료 표적으로 공부하고 감염을 통제하는 전략을 개발하는 것이 필요합니다. 우리는 그것의 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다아제 (NA) 봉투 당단백질, HA 및 NA의 재분류 특성의 기능 분석을 포함하여 조류 인플루엔자 바이러스를 연구하는 고체 바이러스 성 가성 입자 (pp) 플랫폼을 개발했습니다. 수용체, 트로피즘, 중화 항체, 진단, 감염, 약물 개발 및 백신 설계의 목적을 위해. 여기서, 우리는 2개의 인플루엔자 A 균주(HAPI H5N1 및 2013 조류 H7N9)로부터 엔벨로프 당단백질(HA, NA)을 가진 pps를 확립하는 실험 적 절차를 기술한다. 그들의 생성은 pp에 봉투 당단백질을 통합하기 위하여 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)와 같은 몇몇 바이러스의 수용량에 근거를 두었습니다. 또한 이러한 pps가 RT-qPCR로 정량화되는 방법, 그리고 H및 NA의 기원에 따라 네이티브 및 불일치 바이러스 pps의 감염 성 검출방법을 자세히 설명합니다. 이 시스템은 매우 유연하고 적응력이 있으며 봉투 당단백질로 바이러스 pps를 확립하는 데 사용할 수 있으며 다른 유형의 봉투 바이러스에 통합 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 바이러스 성 입자 플랫폼은 많은 연구 조사에서 야생 바이러스를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
바이러스 입자의 임무는 감염된 숙주 세포로부터 비감염숙주 세포로 게놈을 수송하고 이를 복제 유능한 형태1에서세포질 또는 핵으로 전달하는 것이다. 이 프로세스는 처음에 호스트 세포 수용 체에 바인딩에 의해 트리거됩니다., virion와 세포 막의 융합 다음. 인플루엔자 바이러스와 같은 포위 된 바이러스의 경우, 스파이크 당단백질은 수용체 결합 및 융합1,2를담당합니다. Viral envelope glycoproteins (e.g., pyrogens, antigens), are involved in many important properties and events, such as virus lifecycle initiation (binding and fusion), viral pathogenesis, immunogenicity, host cell apoptosis and cellular tropism, the cellular endocytic pathway, as well as interspecies transmission and reassortment1,3,4,5,6,7. 바이러스 성 봉투 당단백질에 대한 연구는 바이러스 감염 과정의 많은 측면을 이해하는 데 도움이됩니다. 의사형 바이러스 입자(pp)는 또한 의사 입자 또는 의사 입자라고도 하며, 가성 화 기법을 통해 생성될 수 있다8,9,10. 이 기술은 C형 간염11,12형,B형 간염13형,수포성 구내염 바이러스(VSV)14, 15,및 인플루엔자 바이러스16,17,18,19를포함한 많은 바이러스의 가성 입자를 개발하는 데 사용되어 왔다. 이 기술은 렌티바이러스 또는 다른 레트로바이러스의 개그폴 단백질을 기반으로 합니다.
가성형 바이러스 입자는 바이러스 봉투 당단백질 발현 플라스미드, 봉투 env 유전자를 누락한 레트로바이러스 패키징 플라스미드, 및 pp 생산자 세포내로의 별도의 리포터 플라스미드를 교전시킴으로써 3-플라스미드 시스템을 사용하여 수득될 수 있다. 레트로바이러스는 개그 단백질에 의해 조립되고, 바이러스 봉투 단백질1을발현하는 감염된 세포막에서 싹이 나고 있다. 따라서, 레트로바이러스 개그 단백질을 이용하여 고역인플루엔자 pps를 획득하여 인플루엔자 HA 및 NA를 발현하는 세포막상에서 싹을 생성할 수 있다. 우리의 이전 연구에서, 모든 조합의 HA /NA는 기능적이었고 바이러스 성 수명 주기16,17,18,20,21에서해당 기능을 수행 할 수 있었습니다. 이러한 pps는 hemagglutination, neuraminidase 활동, HA 수용체 결합 트로피즘, 및 감염을 포함하는 인플루엔자 생물학적 특성을 조사하기 위해 사용된다. HA와 NA는 바이러스 성 수명 주기에서 중요한 표면 기능성 단백질이기 때문에, 인플루엔자의 다른 변종에서 파생된 불일치하는 HA 및 NA는 부분적으로 그들 사이의 재분류를 입증할 수 있습니다. 여기서, 우리는 2개의 하스와 2개의 NA (HPAI H5N1 긴장 및 H7N9 얼룩에서 파생된)를 결합하여 8가지 유형의 인플루엔자 pps를 생성합니다. pps의 이 8가지 모형은 2개의 네이티브 pps, H5N1pp, H7N9pp를 포함합니다; 두 개의 일치하지 않는 PPS, (H5 + N9)pp, (H7 + N1)pp; 단일 당단백질(HA 또는 NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. H5N1 및 H7N9와 같은 인플루엔자 바이러스에 대한 연구는 생체 안전성 요건에 의해 제한됩니다. 야생 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 모든 연구는 생물 안전 수준 3 (BSL-3) 실험실에서 수행되어야합니다. 가성형 바이러스 입자 기술은 생체 안전 도 2(BSL-2) 설정에서 인공 비리온을 패키징하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 pps는 두 가지 주요 당단백질인 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)에 따라 인플루엔자 바이러스 과정을 연구하는 보다 안전하고 유용한 도구를 나타냅니다.
이 프로토콜은 3-plasmid cotransfection 전략(그림 1에서검토됨), pps를 정량화하는 방법 및 감염성 검출을 통해 이러한 pps의 생성을 설명합니다. pp 생산에는 플라스미드의 3가지 종류가 포함됩니다(그림1). 레트로바이러스 개그폴 단백질을 인코딩하는 개그폴 유전자는 레트로바이러스 패키징 키트에서 복제하여 pcDNA 3.1 플라스미드에 삽입하고 PCDNA-Gag-Pol로 명명하였다. 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 유전자는 pTRE-EGFP 벡터에서 복제되고 pcDNA 3.1 플라스미드에 삽입되고 pcDNA-GFP라고 합니다. 복제 동안, 패키징 신호(θ) 시퀀스가 프라이머를 통해 첨가되었다. HA 및 NA 유전자는 각각 pVRC-HA 및 pVRC-NA라는 pVRC 플라스미드로 복제되었다. 마지막 플라스미드는 융합 단백질을 인코딩하고 관심 있는 임의의 다른 융합 단백질로 대체할 수 있다. 우리의 의사 티핑 플랫폼은 두 개의 당단백질 발현 플라스미드를 포함합니다: pVRC-HA 및 pVRC-NA. 이 BSL-2 설정에서 다른 바이러스 긴장 사이 재분류에 대 한 연구를 단순화할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 BSL-2 설정에서 인플루엔자 바이러스 가성 입자(pp)를 생성하는 방법을 설명한다. 리포터 플라스미드 pcDNA-GFP는 pps에 통합되고 감염성 분석에서 FACS에 의해 pps를 정량화하는데 사용될 수 있다. 우리는 인플루엔자 연구에 널리 사용되기 때문에 두 가지 유형의 영향을 받기 쉬운 세포주를 선택했습니다. MDCK 세포는 이러한 연구에서 사용되는 가변 불멸의 인간 세포에 좋은 대?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 절강 성 의학 및 건강 과학 기술 계획 (보조금 번호, 2017KY538), 항저우 시 의학 및 건강 과학 기술 계획 (보조금 번호, OO20190070), 항저우 의학 및 항저우 의학 및 기술 계획에서 보조금에 의해 지원되었다 기술 핵심 프로젝트 (그랜트 번호, 2014Z11) 및 사회 개발 및 과학 연구의 항저우 시 자치 응용 프로그램 프로젝트 (그랜트 번호, 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
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