Summary

Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires

Published: January 15, 2020
doi:

Summary

Ce protocole décrit un processus expérimental pour produire des particules virales pseudotyped infectieuses à haut titre (pp) avec des glycoprotéines d’enveloppe de deux souches de grippe A et comment déterminer leur infectiosité. Ce protocole est très adaptable pour développer des pps de n’importe quel autre type de virus enveloppés avec différentes glycoprotéines d’enveloppe.

Abstract

La transmission directe occasionnelle du virus hautement pathogène de la grippe aviaire A H5N1 (HPAI H5N1) et du H7N9 aux humains et leur létalité sont de graves problèmes de santé publique et suggèrent la possibilité d’une épidémie. Cependant, notre compréhension moléculaire du virus est rudimentaire, et il est nécessaire d’étudier les propriétés biologiques de ses protéines enveloppe comme cibles thérapeutiques et de développer des stratégies pour contrôler l’infection. Nous avons développé une plate-forme solide de particules pseudotypées virales (pp) pour étudier le virus de la grippe aviaire, y compris l’analyse fonctionnelle de son enveloppe d’hémagglutinine (HA) et de neuraminidase (NA) glycoprotéines, les caractéristiques de réassortiment des HA et des NA, récepteurs, les tropismes, neutralisant les anticorps, le diagnostic, l’infectiosité, aux fins du développement de médicaments et de la conception de vaccins. Ici, nous décrivons une procédure expérimentale pour établir des pps avec les glycoprotéines d’enveloppe (HA, NA) de deux souches de grippe A (HAPI H5N1 et 2013 H7N9 aviaire). Leur génération est basée sur la capacité de certains virus, tels que le virus de la leucémie murine (MLV), d’incorporer des glycoprotéines enveloppe dans un pp. En outre, nous détaillons également comment ces pps sont quantifiés avec RT-qPCR, et la détection d’infectiosité des pps indigènes et inadaptés de virus selon l’origine des HAs et des NAs. Ce système est très flexible et adaptable et peut être utilisé pour établir des pps viraux avec des glycoprotéines enveloppe qui peuvent être incorporés dans n’importe quel autre type de virus enveloppé. Ainsi, cette plate-forme de particules virales peut être utilisée pour étudier les virus sauvages dans de nombreuses recherches.

Introduction

La mission d’une particule virale est de transporter son génome d’une cellule hôte infectée à une cellule hôte non infectée et de le livrer dans le cytoplasme ou le noyau sous une forme de réplication-compétente1. Ce processus est d’abord déclenché par la liaison aux récepteurs cellulaires hôtes, suivie par la fusion de virion et de membranes cellulaires. Pour les virus enveloppés, comme les virus grippaux, les glycoprotéines à pointe sont responsables de la liaison des récepteurs et de la fusion1,2. Les glycoprotéines d’enveloppe virale (par exemple, pyrogènes, antigènes), sont impliquées dans beaucoup de propriétés et d’événements importants, tels que l’initiation de cycle de vie de virus (liaison et fusion), la pathogénie virale, l’immunogénicité, l’apoptose de cellules d’hôte et le tropisme cellulaire, la voie endocytique cellulaire, aussi bien que la transmission et le reassortiment interspécifiques1,3,4,5,6,7. La recherche sur les glycoprotéines d’enveloppe virale nous aidera à comprendre beaucoup d’aspects du processus d’infection virale. Les particules virales pseudotypées (pp), aussi appelées pseudovirions ou pseudoparticules, peuvent être générées par une technique de pseudotypage8,9,10. Cette technologie a été utilisée pour développer des particules pseudotypées de nombreux virus, y compris l’hépatite C11,12, l’hépatite B13, virus de la stomatérite vésiculaire (VSV)14,15, et le virus de la grippe16,17,18,19. Cette technologie est basée sur la protéine Gag-Pol des lentivirus ou d’autres rétrovirus.

Les particules virales pseudotypées peuvent être obtenues à l’aide d’un système à trois plasmides en cotransfectant une enveloppe virale d’expression de glycoprotéine plasmide, un plasmide d’emballage rétroviral manquant le gène env d’enveloppe, et un plasmide de journaliste séparé dans les cellules de producteur pp. Le rétrovirus est assemblé par sa protéine Gag, et il bourgeonne à partir d’une membrane cellulaire infectée qui exprime la protéine enveloppe virale1. Par conséquent, il est possible d’obtenir des pps de grippe de haute titer utilisant la protéine de Gag rétrovirus pour produire des bourgeons sur une membrane cellulaire exprimant l’influenza HA et NA. Dans nos études précédentes, les H/NA dans toutes les combinaisons étaient fonctionnels et capables d’exécuter leurs fonctions correspondantes dans le cycle de vie viral16,17,18,20,21. Ces pps sont employés pour étudier des caractéristiques biologiques de grippe, y compris l’hémagglutination, l’activité de neuraminidase, le tropisme liant de HA-récepteur, et l’infectiosité. Étant donné que l’HA et l’AN sont deux protéines fonctionnelles de surface importantes dans le cycle de vie viral, les H et les NA dépareillés dérivés de différentes souches de la grippe peuvent en partie démontrer le réassortiment entre eux. Ici, nous produisons huit types de pps de grippe en combinant deux HAs et deux NA (dérivé de la souche H5N1 de HPAI et de la tache H7N9), utilisant un système de pseudotypage à trois plasmides. Ces huit types de pps comprennent deux pps indigènes, H5N1pp, H7N9pp; deux pps dépareillés, (H5-N9)pp, (H7-N1)pp; et quatre pps hébergeant seulement une seule glycoprotéine (HA ou NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Les études sur le virus de l’influenza, telles que H5N1 et H7N9, sont limitées par des exigences de biosécurité. Toutes les études sur les souches du virus de l’influenza sauvage doivent être effectuées dans un laboratoire de biosécurité de niveau 3 (BSL-3). La technologie des particules virales pseudotypées peut être utilisée pour emballer une virion artificielle dans un cadre de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Par conséquent, les pps représentent un outil plus sûr et utile pour étudier les processus de virus de l’influenza en fonction de ses deux glycoprotéines principales : l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA).

Ce protocole décrit la génération de ces pps avec une stratégie de cotransfection à trois plasmides (survu la figure 1),comment quantifier les pps, et la détection de l’infectiosité. La production pp implique trois types de plasmides (Figure 1). Le gène gag-pol, qui code la protéine rétrovirus Gag-Pol, a été cloné à partir d’un kit d’emballage rétrovirus et inséré dans le plasmide pcDNA 3.1 et nommé pcDNA-Gag-Pol. Le gène amélioré de protéine fluorescente verte (eGFP), qui code la protéine fluorescente verte, a été cloné du vecteur de pTRE-EGFP, inséré dans le plasmide de PCDNA 3.1, et appelé pcDNA-GFP. Pendant le clonage, une séquence de signal d’emballage a été ajoutée par l’intermédiaire d’une amorce. Les gènes HA et NA ont été clonés dans un plasmide pVRC, nommé pVRC-HA et pVRC-NA, respectivement. Le dernier plasmide code la protéine de fusion et peut être remplacé par n’importe quelle autre protéine de fusion d’intérêt. Notre plate-forme de pseudotypage comprend deux plasmides d’expression de glycoprotéine : pVRC-HA et pVRC-NA. Cela peut simplifier la recherche sur le réassortiment entre les différentes souches virales dans un cadre BSL-2.

Protocol

1. Jour 1 : Culture cellulaire et ensemencement Cultiver le rein embryonnaire humain (HEK) 293T/17 cellules dans des plats de 60 mm avec le milieu essentiel modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 U/mL pénicilline-streptomycine (DMEM Complete Medium, DCM) dans un 37 c, 5% de dioxyde de carbone (CO 2) (CO2)REMARQUE : Les cellules à faible passage HEK 293T/17 sont recommandées. Lavez soigneusement les cellules avec 5 ml de phosphate tamponné …

Representative Results

Selon la procédure générale décrite ci-dessus, nous avons généré 10 types de pps combinant deux h/NA de groupe ou glycoprotéine vsV-G ou glycoprotéines sans enveloppe (indiquées dans le tableau 1). Sept d’entre eux sont infectieux. Les pps qui abritent de la glycoprotéine sans enveloppe ou qui n’abritent que NA n’ont montré aucune infectiosité ici. La procédure de production de la grippe pp est examinée à la figure 1. Les micrographies électroniques de trans…

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour produire des particules pseudotypées de virus de grippe (pp) dans un arrangement de BSL-2. Le plasmique du plasmique pcDNA-GFP est incorporé dans les pps et peut être utilisé pour quantifier les pps par FACS dans un test d’infectiosité. Nous avons choisi deux types de lignées cellulaires sensibles parce qu’elles sont largement utilisées dans la recherche sur l’influenza. Les cellules MDCK fourniraient un bon contrôle aux cellules humaines immortalisées variabl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions du Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science et Projet clé technologique (Grant Numbers, 2014Z11) et Projet municipal d’application autonome de Hangzhou de développement social et de recherche scientifique (Grant Numbers, 20191203B134).

Materials

Benzonase Nuclease Millipore 70664 Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) Corning 3599 Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) Costar 3516 Individual alphanumerical codes for well identification
Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM) Gibco 11965092 A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serum Excell FND500 fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Beckman coulter cytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells ATCC CRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells ATCC CRL-11268 A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscope Olympus BX51-32P01-FLB3
Inverted light microscope Olympus CKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019 Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit NEB E3006L Will withstand up to 14,000 RCF
RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells ATCC CCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Axygen MCT-150-C 33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF Millipore SLHV033RS an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 11058021 The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Maximum RCF is 12,500 xg
Temperature range from -80 °C to 120 °C
RNase-/DNase-free
Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL) Corning 430791 a stable and highly reactive serine protease
Proteinase K Beyotime ST532 Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm) Corning 430166 Trypsin from bovine pancreas
TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsin Sigma T1426 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056

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Zhang, F., Wang, Y., Shang, X., Wang, S., Xiao, R., Zhou, H., Cai, L. Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses. J. Vis. Exp. (155), e60663, doi:10.3791/60663 (2020).

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