Использование куриных хориоаллантоических Membrane In Vivo Модель для изучения гинекологических и урологических раков
Summary
Мы представляем куриную модель хориоаллантоической мембраны в качестве альтернативной, трансплантируемой модели in vivo для прививок гинекологических и урологических раковых клеток и опухолей, полученных пациентом.
Abstract
Мыши модели являются эталоном испытаний для исследования рака in vivo. Тем не менее, стоимость, время и этические соображения привели к призывам к альтернативным моделям рака in vivo. Модель куриной хориоаллантоической мембраны (CAM) обеспечивает недорогую, быструю альтернативу, которая позволяет прямую визуализацию развития опухоли и подходит для визуализации in vivo. Таким образом, мы стремились разработать оптимизированный протокол для привить гинекологических и урологических опухолей в эту модель, которую мы представляем здесь. Примерно через 7 дней послеоплодное, воздушная клетка перемещается в васкуляризованную сторону яйцеклетки, где отверстие создается в скорлупе. Опухоли из мурин и клеточных линий человека и первичных тканей могут быть привиты. Они, как правило, семенами в смеси внеклеточной матрицы и среды, чтобы избежать клеточного рассеивательства и обеспечить поддержку питательных веществ, пока клетки набирать сосудистой питания. Опухоли могут расти еще до 14 дней до вылупления яйцеклеток. Путем имплантации клеток, стабилизируемых светлячков ойлиферазой, биолюминесценция может быть использована для чувствительного обнаружения роста опухоли на мембране и раковой клетки распространяются по всему эмбриону. Эта модель потенциально может быть использована для изучения опухоли, вторжения, метастази и терапевтической эффективности. Модель chicken CAM требует значительно меньше времени и финансовых ресурсов по сравнению с традиционными моделями мурина. Поскольку яйца иммунокомпромиссны и невосприимчивы, ткани любого организма потенциально могут быть имплантированы без дорогостоящих трансгенных животных (например, мышей), необходимых для имплантации тканей человека. Тем не менее, многие из преимуществ этой модели потенциально могут быть ограничения, в том числе короткое время генерации опухоли и иммунокомпромисс / иммунный толерантный статус. Кроме того, хотя все типы опухолей, представленные здесь, прививаются в модели куриной хориоаллантоической мембраны, они делают это с различной степенью роста опухоли.
Introduction
Мыши служили классическим образцовым организмом для изучения заболеваний человека, в том числе злокачественных новообразований. Как млекопитающие, они имеют много общего с людьми. Их высокая степень генетического сходства позволила трансгенных манипуляций генома мыши, чтобы обеспечить огромное понимание генетического контроля заболеваний человека1. Обширный опыт в обработке и экспериментировать с мышами привел к тому, что они являются моделью выбора для биомедицинских исследований. Однако, в дополнение к этическим и научным проблемам, касающимся моделей мурин, они также могут быть довольно дорогостоящими и трудоемкими2,3. Развитие опухолей может занять недели или даже месяцы. Корпус в типичном учреждении в одиночку может работать в сотни до тысячи долларов в то время как опухоли развиваются. Рак яичников является примером этого недостатка, потому что его рост в моделях мурина может легко занять месяцы. Задержки в исследованиях прогресс потенциально влияние рака яичников пациентов постоянно низкий 5-летний показатель выживаемости только 47% (т.е., увеличение выживаемости только 10% в течение 30 лет)4. Аналогичным образом, урологические раковые заболевания (рак почек, простаты и мочевого пузыря) составляют 19% всех случаев рака в Соединенных Штатах и 11% случаев смерти, связанных с раком4. Таким образом, новый подход in vivo к изучению гинекологического и урологического рака может сэкономить лаборатории значительное время, труд и деньги, даже если эта модель применяется только для первоначальных экспериментов скрининга. Кроме того, в результате ускорения результатов исследований может значительно повлиять на 177000 лиц с диагнозом этих видов рака ежегодно.
Модель chicken CAM предлагает множество преимуществ, которые решают вышеупомянутые проблемы. Популярная модель для изучения ангиогенеза5,6, вторжение опухолевых клеток7,8,и метастазирование7,9, модель cam эмбриона цыпленка уже был использован для изучения многих форм рака, в том числе глиомы10,12,12, головы и шеи плоскоклеточной карциномы13,14, лейкемия15,16, рак от рака от утротротроя колоректальный рак18. Кроме того, CAM модели были созданы для нейробластомы19, Лимфома Буркитт20, меланома21, и кошачьей фибросаркомы22. Предыдущие исследования также представили прививки рака мочевого пузыря23 и рак предстательной железы клетоклиний 24, но с ограниченным и с ограниченным протоколом детали. Не только яйца гораздо дешевле, чем мыши, но они также производят высоко воспроизводимые результаты25,26. Они показывают быстрое развитие сосуды, и прививок опухоли может произойти в так быстро, как несколько дней и быть визуализированы продольно через открытое окно. С 21-дневный промежуток времени между оплодотворением яйцеклеток и штриховки, эксперименты могут быть завершены в течение нескольких недель. Кроме того, низкая стоимость, ограниченные потребности в жилье и небольшие размеры легко позволяют крупномасштабные эксперименты, которые были бы запретительными для изучения мышей.
Поэтому мы стремились оптимизировать модель CAM для прививок гинекологического и урологического рака. Из-за иммунокомпромиссного статуса раннего куриного эмбриона27,как мыши, так и человеческие клетки могут быть легко имплантированы. Таким образом, мы успешно привили рака яичников, почек, простаты и мочевого пузыря. Для каждого из этих типов опухоли, CAM легко принимает установленные линии морин и / или человеческих опухолевых клеток. Важно отметить, что свежесобранные первичные ткани опухоли человека могут также привить либо из переваренных клеток или кусочков твердой ткани с высоким уровнем успеха. Каждый из этих типов рака и источников клеток требует оптимизации, которую мы разделяем здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Расширение опухоли и прививок с помощью модели CAM позволяет более быстрый и непосредственно наблюдаемый рост опухоли, чем существующие модели животных in vivo. Кроме того, затраты значительно ниже, как только первоначальная покупка оборудования завершена, особенно по сравнению со стоимо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Фуюхико Таманои и Бинь Ву за начальную подготовку по этому методу. Обсуждения с д-ром Евой Козиолек сыграли важную роль в оптимизации этого подхода и были высоко оценены. Эта работа была бы невозможна без финансирования из следующих источников: Программа исследований заболеваний, связанных с табаком, Постдокторская стипендия (27FT-0023, в ACS), Министерство обороны (МО) Программы исследований рака яичников (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), Программа исследований заболеваний, связанных с табаком, High Impact Pilot Award (27IR-0016) и институциональная поддержка UCLA, включая грант семян JCCC (NCI/NIH P30CA016042) и грант 3R от офиса вице-канцлера по исследованиям в LW.
Materials
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
- Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
- . SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016 Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018)
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12 (2017).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).
- Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815 (2011).
- Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
- Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686 (2017).
- Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).
- Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).
- Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).
- Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
- Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).
- Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
- Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).
- Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
- Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
