Vi presentiamo il modello di membrana corioallantoica del pollo come modello alternativo, trapiantabile, in vivo per l’innesto di linee cellulari del cancro ginecologico e urologico e tumori derivati dal paziente.
I modelli murini sono i test di riferimento per gli studi sul cancro in vivo. Tuttavia, i costi, i tempi e le considerazioni etiche hanno portato a richieste di modelli alternativi di cancro in vivo. Il modello di membrana corioalltoica di pollo (CAM) fornisce un’alternativa rapida e economica che consente la visualizzazione diretta dello sviluppo del tumore ed è adatta per l’imaging in vivo. Come tale, abbiamo cercato di sviluppare un protocollo ottimizzato per l’ingoiare i tumori ginecologici e urologici in questo modello, che presentiamo qui. Circa 7 giorni dopo la fecondazione, la cella d’aria viene spostata sul lato vascolarizzato dell’uovo, dove viene creata un’apertura nel guscio. I tumori da linee cellulari murine e umane e tessuti primari possono quindi essere innestati. Questi sono tipicamente semi in una miscela di matrice extracellulare e mezzo per evitare la dispersione cellulare e fornire supporto nutritivo fino a quando le cellule reclutano una fornitura vascolare. I tumori possono quindi crescere fino a 14 giorni aggiuntivi prima della schiusa delle uova. Impiantando cellule correttamente trasdotte con luciferasi della lucciola, l’imaging della bioluminescenza può essere utilizzato per il rilevamento sensibile della crescita tumorale sulla membrana e le cellule tumorali si diffondono in tutto l’embrione. Questo modello può essere potenzialmente utilizzato per studiare la tumorigenicità, l’invasione, la metastasi e l’efficacia terapeutica. Il modello di pollo CAM richiede molto meno tempo e risorse finanziarie rispetto ai modelli murini tradizionali. Poiché le uova sono immunocompromesse e tolleranti immunitarie, i tessuti di qualsiasi organismo possono essere potenzialmente impiantati senza costosi animali transgenici (ad esempio, topi) necessari per l’impianto dei tessuti umani. Tuttavia, molti dei vantaggi di questo modello potrebbero potenzialmente essere anche limitazioni, tra cui il breve tempo di generazione del tumore e lo stato di tolleranza immunocompromessa/immune. Inoltre, anche se tutti i tipi di tumore presentati qui innesto nel modello di membrana corioallantoica di pollo, lo fanno con vari gradi di crescita del tumore.
I topi sono serviti come il classico organismo modello per lo studio delle malattie umane, compresa la malignità. Come mammiferi, condividono molte somiglianze con gli esseri umani. Il loro alto grado di somiglianza genetica ha permesso la manipolazione transgenica del genoma del topo per fornire enormi informazioni sul controllo genetico delle malattie umane1. Un’ampia esperienza nella gestione e sperimentazione dei topi ha portato al loro essere il modello di scelta per la ricerca biomedica. Tuttavia, oltre alle preoccupazioni etiche e scientifiche riguardanti i modelli murini, possono anche essere piuttosto costose e dispendiose in termini di tempo2,3. Lo sviluppo dei tumori può richiedere settimane o addirittura mesi. L’alloggiamento in un’istituzione tipica da solo può funzionare in centinaia a migliaia di dollari mentre i tumori si stanno sviluppando. Il cancro ovarico è un esempio di questo inconveniente perché la sua crescita nei modelli murini può facilmente richiedere mesi. I ritardi nei progressi della ricerca hanno un potenziale impatto sul tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti affetti da cancro ovarico, pari solo al 47% (ossia un aumento della sopravvivenza di appena il 10% in 30 anni)4. Allo stesso modo, i tumori urologici (cancro del rene, della prostata e della vescica) costituiscono il 19% di tutti i casi di cancro negli Stati Uniti e l’11% dei decessi correlati al cancro4. Così, un nuovo approccio in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici potrebbe far risparmiare a un laboratorio molto tempo, lavoro e denaro, anche se questo modello viene applicato solo agli esperimenti di screening iniziali. Inoltre, la conseguente accelerazione dei risultati della ricerca potrebbe avere un impatto significativo i 177.000 individui diagnosticati con questi cancri ogni anno.
Il modello CAM di pollo offre molti vantaggi che affrontano i problemi di cui sopra. Un modello popolare per studiare l’angiogenesi5,6, invasione delle cellule tumorali7,8, e metastasi7,9, il modello CAM embrione pulcino è già stato utilizzato per studiare molte forme di cancro, tra cui glioma10,11,12, testa e collo carcinoma a cellule squamose13,14, leucemia15,16, cancro al pancreas17, cancro colorettale18. Inoltre, sono stati generati modelli CAM per neuroblastoma19, linfoma Burkitt20, melanoma21e fibrosarcoma felino22. Studi precedenti hanno anche presentato l’innesto di cancro della vescica23 e linee cellulari del cancro alla prostata24, ma con dettagli di protocollo limitati. Non solo le uova sono molto più economiche dei topi, ma producono anche risultati altamente riproducibili25,26. Essi mostrano lo sviluppo di vascolatura veloce, e l’afflusso di tumore può verificarsi in più rapidamente come pochi giorni ed essere visualizzato longitudinalmente attraverso la finestra aperta. Con il periodo di tempo di 21 giorni tra la fecondazione ovula e la schiusa, gli esperimenti possono essere completati in poche settimane. Inoltre, il basso costo, le limitate esigenze abitative e le piccole dimensioni consentono facilmente esperimenti su larga scala che sarebbero proibitivi per gli studi sui topi.
Pertanto, abbiamo cercato di ottimizzare il modello CAM per l’innesto di tumori ginecologici e urologici. A causa dello stato immunocompromesso del primo embrione di pollo27, sia le cellule del topo che quella umana possono essere facilmente impiantate. Come tale, abbiamo innestato con successo tumori ovarici, renali, prostatici e della vescica. Per ciascuno di questi tipi di tumore, la CAM accetta prontamente le linee cellulari del topo e/o del tumore umano. È importante sottolineare che i tessuti tumorali primari appena raccolti possono anche innestare cellule digerite o pezzi di tessuto solido con alti tassi di successo. Ognuno di questi tipi di cancro e fonti cellulari richiede ottimizzazione, che condividiamo qui.
L’espansione e l’innesto del tumore con il modello CAM consentono una crescita tumorale più rapida e direttamente osservabile rispetto ai modelli animali in vivo esistenti. Inoltre, i costi sono significativamente più bassi una volta completato l’acquisto iniziale di attrezzature, soprattutto se confrontato con il costo dei topi immunocompromessi. Lo stato iniziale, immunocompromesso degli embrioni di pollo, consente facilmente l’innesto di tessuto umano e murino. Anche con questi punti di forza, il modello CAM ha dell…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Fuyuhiko Tamanoi e Binh Vu per la formazione iniziale su questo metodo. Le discussioni con la Dott.ssa Eva Koziolek sono state determinanti nell’ottimizzazione di questo approccio e sono state molto apprezzate. Questo lavoro non sarebbe stato possibile senza il finanziamento delle seguenti fonti: il programma di ricerca sulle malattie relative al tabacco Postdoctoral Fellowship (27FT-0023, ACS), il Department of Defense (DoD) Ovarian Cancer Research Program (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), Tobacco-Related Disease Research Program High Impact Pilot Award (27IR-0016) e il supporto istituzionale UCLA, tra cui un JCCC Seed Grant (NCI/NIH P30CA016042) e una sovvenzione 3R dall’Ufficio del Vice Cancelliere per la Ricerca a LW.
-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |