Apresentamos o modelo de membrana chorioallantoico de frango como uma alternativa, transplantável, no modelo vivo para o enenxerto de linhas de células cancerígenas ginecológicas e urológicas e tumores derivados do paciente.
Os modelos mouse são os testes de referência para estudos de câncer vivo. No entanto, o custo, o tempo e as considerações éticas levaram a pedidos de alternativas nos modelos de câncer vivo. O modelo de membrana chorioallantoico de frango (CAM) fornece uma alternativa barata e rápida que permite a visualização direta do desenvolvimento do tumor e é adequada para a imagem in vivo. Como tal, buscamos desenvolver um protocolo otimizado para enenxerto de tumores ginecológicos e urológicos nesse modelo, que apresentamos aqui. Aproximadamente 7 dias após a fertilização, a célula do ar é movida para o lado vascularizado do óvulo, onde uma abertura é criada na concha. Tumores de murina e linhas celulares humanas e tecidos primários podem então ser ertados. Estes são tipicamente semeados em uma mistura de matriz extracelular e meio para evitar dispersão celular e fornecer suporte de nutrientes até que as células recrutem um suprimento vascular. Os tumores podem crescer por até 14 dias adicionais antes da eclosão dos ovos. Ao implantar células stably transinduzidas com luciferase firefly, a imagem de bioluminescência pode ser usada para a detecção sensível do crescimento tumoral na membrana e células cancerígenas espalhadas pelo embrião. Esse modelo pode potencialmente ser usado para estudar tumorigenicidade, invasão, metástase e eficácia terapêutica. O modelo CAM de frango requer significativamente menos tempo e recursos financeiros em comparação com os modelos tradicionais de murina. Como os ovos são imunocomprometidos e tolerantes imunes, tecidos de qualquer organismo podem potencialmente ser implantados sem animais transgênicos caros (por exemplo, camundongos) necessários para implantação de tecidos humanos. No entanto, muitas das vantagens deste modelo poderiam potencialmente também ser limitações, incluindo o curto tempo de geração de tumores e o status imunocomprometido/imunocomprometido/tolerante imune. Além disso, embora todos os tipos de tumores apresentados aqui enerram no modelo de membrana chorioallantoico de frango, eles o fazem com diferentes graus de crescimento tumoral.
Os camundongos serviram como o organismo modelo clássico para o estudo de doenças humanas, incluindo a malignidade. Como mamíferos, eles compartilham muitas semelhanças com os humanos. Seu alto grau de similaridade genética permitiu que a manipulação transgênica do genoma do camundongo fornecesse uma enorme visão sobre o controle genético das doenças humanas1. A vasta experiência no manuseio e experimentação com camundongos resultou em seu ser o modelo de escolha para pesquisa biomédica. No entanto, além das preocupações éticas e científicas em relação aos modelos de murina, eles também podem ser bastante caros e demorados2,3. O desenvolvimento de tumores pode levar semanas ou até meses. A moradia em uma instituição típica sozinha pode funcionar entre centenas e milhares de dólares enquanto os tumores estão se desenvolvendo. O câncer de ovário é um exemplo dessa desvantagem porque seu crescimento em modelos de urina pode facilmente levar meses. Atrasos no progresso da pesquisa potencialmente afetam a persistente baixa taxa de sobrevivência de pacientes com câncer de ovário de apenas 47% (ou seja, um aumento na sobrevida de apenas 10% ao longo de 30 anos)4. Da mesma forma, os cânceres urológicos (cânceres de rim, próstata e bexiga) constituem 19% de todos os casos de câncer nos Estados Unidos e 11% das mortes relacionadas ao câncer4. Assim, uma nova abordagem in vivo para estudar cânceres ginecológicos e urológicos poderia economizar um tempo, trabalho e dinheiro consideráveis, mesmo que esse modelo seja aplicado apenas a experimentos iniciais de triagem. Além disso, a aceleração resultante dos achados da pesquisa poderia impactar significativamente os 177.000 indivíduos diagnosticados com esses cânceres anualmente.
O modelo CAM de frango oferece muitas vantagens que abordam as questões acima mencionadas. Um modelo popular para estudar angiogênese5,6, invasão celular tumoral7,8, e metástase7,9, o modelo de cam de embrião filhote já foi usado para estudar muitas formas de câncer, incluindo glioma10,11,12, carcinoma celular cabeça e pescoço13,14, leucemia15,16, câncer pancreático17, e câncer colorretal18. Além disso, os modelos CAM foram gerados para neuroblastoma19,linfoma burkitt20,melanoma21e fibrosarcoma felina22. Estudos anteriores também apresentaram enenxerto de câncer de bexiga23 e linhas de células cancerígenas de próstata24,mas com detalhes limitados do protocolo. Não só os ovos são muito mais baratos que os ratos, mas também produzem resultados altamente reprodutíveis25,26. Eles mostram o desenvolvimento rápido da vasculatura, e o enenxerto tumoral pode ocorrer tão rapidamente quanto alguns dias e ser visualizado longitudinalmente pela janela aberta. Com o período de 21 dias entre fertilização de óvulos e eclosão, os experimentos podem ser concluídos dentro de algumas semanas. Além disso, as necessidades de moradia limitadas de baixo custo, e o pequeno tamanho prontamente permitem experimentos em larga escala que seriam proibitivos para estudos de camundongos.
Por isso, buscamos otimizar o modelo CAM para o enenxerto de cânceres ginecológicos e urológicos. Devido ao estado imunocomprometido do embrião de frango27precoce, tanto o rato quanto as células humanas podem ser prontamente implantados. Como tal, temos conseguido enenxertor cânceres de ovário, rim, próstata e bexiga. Para cada um desses tipos de tumores, o CAM prontamente aceita linhas estabelecidas de murina e/ou células tumorais humanas. É importante ressaltar que os tecidos tumorais humanos primários recém-colhidos também podem enertar células digeridas ou pedaços de tecido sólido com altas taxas de sucesso. Cada um desses tipos de câncer e fontes celulares requer otimização, que compartilhamos aqui.
A expansão e o enenxerto tumoral usando o modelo CAM permite um crescimento tumoral mais rápido e diretamente observável do que o existente nos modelos animais vivos. Além disso, os custos são significativamente menores uma vez que a compra inicial de equipamentos é concluída, especialmente quando comparada com o custo de camundongos imunocomprometidos. O estado inicial, imunocomprometido de embriões de frango prontamente permite enenxerto de tecido humano e murina. Mesmo com esses pontos fortes, o modelo CAM tem…
The authors have nothing to disclose.
Os autores desejam agradecer ao Dr. Fuyuhiko Tamanoi e Binh Vu pelo treinamento inicial sobre este método. As discussões com a Dra. Este trabalho não teria sido possível sem financiamento das seguintes fontes: o Programa de Pesquisa sobre Doenças Relacionadas ao Tabaco Bolsa de Pós-Doutorado (27FT-0023, à ACS), o Departamento de Defesa (DoD) Programa de Pesquisa do Câncer de Ovário (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco Prêmio Piloto de Alto Impacto (27IR-0016) e apoio institucional da UCLA, incluindo um JCCC Seed Grant (NCI/NIH P30CA016042) e um 3R Grant do Escritório do Vice-Chanceler para Pesquisa para LW.
-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |