Summary

En Vivo Aumento de la Inducción de Células T Regulatorias Gut-Homing

Published: January 22, 2020
doi:

Summary

Aquí presentamos un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de células T reguladoras intestinales. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de la vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y la vitamina A activa (ácido retinoico o RA) de novo.

Abstract

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica inflamatoria en el tracto gastrointestinal (GUT). En los Estados Unidos, hay aproximadamente 1,4 millones de pacientes con EII. Generalmente se acepta que una respuesta inmune desregulada a las bacterias intestinales inicia la enfermedad y interrumpe la barrera epitelial de la mucosa. Recientemente demostramos que las células T reguladoras intestinales (Treg) son una terapia prometedora para la EII. En consecuencia, este artículo presenta un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de la célula Treg intestinal. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir concentraciones localmente altas de dos moléculas de novo, vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y vitamina A activa (ácido retinoico o RA). Elegimos 1,25(OH)2D y RA basándose en hallazgos anteriores que muestran que 1,25(OH)2D puede inducir la expresión de moléculas reguladoras (por ejemplo, la caja de cabecera P3 e interleucina-10) y que la AR puede estimular la expresión de receptores intestinales en células T. Para generar estas células dendríticas diseñadas, utilizamos un vector lentiviral para transducir las células dendríticas para sobreexpresar dos genes. Un gen es el citocromo P450 familia 27 subfamilia B miembro 1 que codifica 25-hidroxivitamina D 1o-hidroxilasa, que cataliza fisiológicamente la síntesis de 1,25(OH)2D. El otro gen es el aldehído deshidrogenasa 1 miembro de la familia A2 que codifica la retinaldehíde deshidrogenasa 2, que cataliza fisiológicamente la síntesis de RA. Este protocolo se puede utilizar para la investigación futura de células Treg intestinales in vivo.

Introduction

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica inflamatoria en el tracto gastrointestinal (GUT). En los Estados Unidos, hay aproximadamente 1,4 millones de pacientes con EII. Generalmente se acepta que una respuesta inmune desregulada a las bacterias intestinales inicia la enfermedad y interrumpe la barrera epitelial mucosa1,2. Por esta razón, actualmente disponibles medicamentos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus sitios) inhiben las funciones de los mediadores inflamatorios o bloquean la localización de células inmunitarias en el intestino. Sin embargo, los mediadores inflamatorios y las células inmunitarias que están dirigidas también son necesarios para las defensas inmunitarias. Como resultado, los inhibidores del mediador inflamatorio comprometen la defensa inmune sistémica y los bloqueadores de homing de células inmunitarias debilitan la defensa inmune intestinal, lo que puede conducir a consecuencias graves3,4. Además, los bloqueadores de homing de células inmunitarias también pueden bloquear la homing de células T reguladoras (Treg) en el intestino y por lo tanto pueden empeorar la tolerancia inmunitaria intestinal ya comprometida en pacientes con EII. Además, el bloqueo de la célula de Treg homing en el intestino también puede conducir a la supresión inmune sistémica debido a la acumulación de células Treg en la sangre5. Por último, los inhibidores y bloqueadores funcionan de forma transitoria y, por lo que, requieren administraciones frecuentes. La administración frecuente de estos inhibidores y bloqueadores puede exacerbar aún más los efectos secundarios adversos.

Recientemente, propusimos una estrategia novedosa que potencialmente puede mitigar o incluso eliminar los efectos secundarios asociados con los fármacos actuales para el tratamiento de la EII6. Esta estrategia aumenta la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos6. La razón de esta estrategia es que las células Treg intestinales específicamente hogar del intestino y por lo tanto no comprometerá las defensas inmunitarias sistémicas. Además, dado que las células Treg pueden potencialmente formar memoria7,8, las células Treg intestinales pueden potencialmente proporcionar un control estable de la inflamación intestinal crónica en pacientes con EII y, por lo tanto, el tratamiento no debe ser necesario administrar con tanta frecuencia. Además, dado que esta estrategia aumenta la inducción de células Treg intestinales in vivo, no tiene la preocupación de la inestabilidad in vivo en un entorno altamente proinflamatorio que se asocia con la transferencia adoptiva de células Treg generadas in vitro9,10. En este sentido, las células Treg generadas in vitro son una de las estrategias propuestas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes11,12,13 y rechazo de trasplante14,15. Finalmente, en esta estrategia, las células dendríticas (CC) están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de dos moléculas de novo: vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y vitamina A activa (ácido retinoico o RA). Elegimos 1,25(OH)2D y RA porque 1,25(OH)2D puede inducir la expresión de moléculas reguladoras (por ejemplo, la caja de cabezal de horquilla P3 [foxp3] e interleucina-10 [IL-10])16,17 y que RA puede estimular la expresión de receptores de homing intestinal en las células T18. Debido a que tanto 1,25(OH)2D como RA también pueden tolerizar los CC28,29,raquemos por ello que los CC de ingeniería se mantendrán establemente en un estado tolerogénico in vivo y, por lo tanto, eludan las preocupaciones de inestabilidad in vivo asociadas con los CC tolerogénicos generados in vitro (TolDCs)19,20,21. En este sentido, los TolDC son también una de las estrategias propuestas para el aumento in vivo de las funciones celulares treg19,20,21. Para apoyar nuestro razonamiento, hemos demostrado que los controladores de tecnología de desarrollo, tras la entrega in vivo, pueden aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos6.

Una ventaja adicional de nuestra estrategia propuesta es que 1,25(OH)2D también tiene otras funciones que potencialmente pueden beneficiar a los pacientes con EII. Estas otras funciones incluyen la capacidad de 1,25(OH)2D para estimular la secreción de antimicrobianos22 y para suprimir la carcinogénesis23. Las infecciones y los cánceres se asocian con frecuencia con la EII24,25.

Para generar los CC que pueden producir concentraciones localmente altas de 1,25(OH)2D y RA de novo, utilizamos un vector lentiviral para diseñar dCs para sobreexpresar dos genes. Un gen es el citocromo P450 familia 27 subfamilia B miembro 1 (CYP27B1) que codifica 25-hidroxivitamina D-hidroxilasa (1o-hidroxilasa), que cataliza fisiológicamente la síntesis de 1,25(OH)2D. El otro gen es el aldehído deshidrogenasa 1 miembro de la familia A2 (ALDH1a2) que codifica la retinaldehíde deshidrogenasa 2 (RALDH2), que cataliza fisiológicamente la síntesis de RA6.

Debido a que el aumento in vivo de la inducción de la célula Treg intestinal es potencialmente importante en el tratamiento de la EII, en el siguiente protocolo detallaremos los procedimientos para la generación de los DC subexpresantes 1–hidroxilasa-RALDH2 (células DC-CYP-ALDH) que se puede utilizar para la futura investigación de células Treg intestinales in vivo.

Protocol

Todos los protocolos de estudio animal in vivo fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad lomána (IACUC), así como por la Oficina de Revisión de Cuidado y Uso de Animales (ACURO) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (USAMRMC) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (USAMRMC) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (…

Representative Results

Las células DC-CYP-ALDH expresaron un aumento significativo de la cantidad de 1o-hidroxilasa. Para determinar si las células DC-CYP-ALDH generadas a partir de BMDC expresaron una cantidad significativamente mayor de 1o-hidroxilasa, los BMDC fueron transducidos con el virus lenti-CYP-ALDH para producir células DC-CYP-ALDH derivadas de médula ósea (células BMDC-CYP-ALDH). Posteriormente, las células BMDC-CYP-ALDH fueron examinadas para la expresión de 1-hidroxilasa por FACS. Nuestros datos mostraro…

Discussion

En este artículo describimos el uso de células DC-CYP-ALDH, para aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos. Nuestros datos han demostrado que las células DC-CYP-ALDH pueden sintetizar concentraciones localmente altas de novo de 1,25(OH)2D y RA in vitro en presencia de sustratos correspondientes (es decir, 25[OH]D y retinol, respectivamente). Debido a que las concentraciones sanguíneas suficientes de 25(OH)D y retinol se pueden lograr fácilmente a través de sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud a través del Programa de Investigación Médica Revisado por Pares bajo el Premio No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por las Becas de Innovación en Investigación del Departamento de Medicina de la Universidad Loma Linda (681207-2967 [XT y GG], 681205-2967 [XT] y 325491 [DJB]).

Materials

10 mL syringes ThermoFisher Scientific Cat# 03-377-23
100 mm x 20 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430167
12-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-82
150 mm x 25 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430559
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) Sigma-Aldrich Cat# H4014
293T cells ATCC CRL-3216
2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
6-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-83
ALDEFLUOR kit Stemcell Technologies Cat# 01700
Anti-CYP27B1 Abcam Cat# ab95047
BD FACSAria II BD Biosciences N/A
CaCl2 Sigma-Aldrich Cat# C1016
CM-10-D cell culture medium DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-10-R cell culture medium RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-4-D cell culture medium DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430513
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430514
Dissecting scissor ThermoFisher Scientific Cat# 08-940
DMEM medium ThermoFisher Scientific Cat# 11960044
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific Cat# 16000044
Forceps ThermoFisher Scientific Cat# 22-327379
Gibco ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific Cat# A1049201
Glycerol Sigma-Aldrich Cat# G5516
Goat anti-rabbit IgG Abcam Cat# ab205718
HEPES Millipore Cat# 391340
Lenti-CYP-ALDH Custom-made 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.
L-glutamine ThermoFisher Scientific Cat#25030081
Lipopolysaccharide Sigma-Aldrich Cat# L3755
Murine GM-CSF Peprotech Cat# 315-03
Murine IL-4 Peprotech Cat# 214-14
Na2HPO4 Sigma-Aldrich Cat# NIST2186II
NaCl Sigma-Aldrich Cat# S9888
Needles ThermoFisher Scientific Cat# 14-841-02
Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
pCMVR8.74 Addgene Plasmid# 22036
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific Cat#15140148
Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
PMD2G Addgene Plasmid# 12259
Polypropylene tube, 15 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12500
Polypropylene tube, 50 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12502
Protamine sulfate Sigma-Aldrich Cat# P3369
Rabbit polycloncal IgG isotype control Abcam Cat# ab171870
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement Heartland Assays
RPMI 1640 medium, no glutamine ThermoFisher Scientific Cat# 21870076
Sodium pyruvat ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
Sorvall Legend XTR Centrifuge ThermoFisher Scientific Cat# 75004521
Sterile Cell strainers, 40 mm ThermoFisher Scientific Cat# 07-201-430
Sterile storage bottles, 500 mL ThermoFisher Scientific Cat# CLS431432

References

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Cite This Article
Bi, H., Wasnik, S., Baylink, D. J., Liu, C., Tang, X. In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction. J. Vis. Exp. (155), e60585, doi:10.3791/60585 (2020).

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