Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming-regulatorischen T-Zell-Induktion vor. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen des aktiven Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und des aktiven VitaminS A (Retinoinsäure oder RA) de novo zu produzieren.
Die entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist eine entzündliche chronische Erkrankung im Magen-Darm-Trakt (GUT). In den Vereinigten Staaten gibt es etwa 1,4 Millionen IBD-Patienten. Es ist allgemein anerkannt, dass eine dysregulierte Immunantwort auf Darmbakterien die Krankheit auslöst und die Schleimhautepithelbarriere stört. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Darmhoming-regulatorische T (Treg)-Zellen eine vielversprechende Therapie für IBD sind. Dementsprechend stellt dieser Artikel ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming Treg-Zellinduktion dar. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen von zwei Molekülen de novo, aktivem Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und aktivem Vitamin A (Retinsäure oder RA) zu produzieren. Wir wählten 1,25(OH)2D und RA auf der Grundlage früherer Erkenntnisse, die zeigten, dass 1,25(OH)2D die Expression von regulatorischen Molekülen induzieren kann (z. B. Gabelstapler-Box P3 und Interleukin-10) und dass RA die Expression von Darm-Homing-Rezeptoren in T-Zellen stimulieren kann. Um solche technisch entwickelten dendritischen Zellen zu erzeugen, verwenden wir einen lentiviralen Vektor, um dendritische Zellen zu transduzieren, um zwei Gene zu überexprimieren. Ein Gen ist das Cytochrom P450-Unterfamilie 27-Unterfamilie B-Mitglied 1, das 25-Hydroxyvitamin D 1-Hydroxylase kodiert, das physiologisch die Synthese von 1,25(OH)2D katalysiert. Das andere Gen ist die Aldehyddehydrogenase 1 Familienmitglied A2, die Retinaldehyddehydrogenase 2 kodiert, die physiologisch die Synthese von RA katalysiert. Dieses Protokoll kann für die zukünftige Untersuchung von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verwendet werden.
Die entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist eine entzündliche chronische Erkrankung im Magen-Darm-Trakt (GUT). In den Vereinigten Staaten gibt es etwa 1,4 Millionen IBD-Patienten. Es ist allgemein anerkannt, dass eine dysregulierte Immunantwort auf Darmbakterien die Krankheit auslöst und die Schleimhautepithelbarriere1,2stört. Aus diesem Grund hemmen derzeit verfügbare, von der US Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Medikamente die Funktionen von Entzündungsmediatoren oder blockieren die Homing von Immunzellen in den Darm. Die entzündungshemmenden Mediatoren und Immunzellen, die gezielt sind, sind jedoch auch für die Immunabwehr notwendig. Infolgedessen gefährden die Entzündungsmediatoren die systemische Immunabwehr und die Immunzellen-Homing-Blocker schwächen die Darmimmunabwehr, die beide zu schwerwiegenden Folgen führen können3,4. Darüber hinaus können die Immunzellen-Homing-Blocker auch das Homing von regulatorischen T (Treg)-Zellen in den Darm blockieren und damit die bereits beeinträchtigte Darmimmuntoleranz bei IBD-Patienten verschlechtern. Darüber hinaus kann die Blockierung der Treg-Zelle, die in den Darm einfließt, auch zu einer systemischen Immunsuppression aufgrund der Ansammlung von Treg-Zellen im Blut führen5. Schließlich funktionieren Inhibitoren und Blocker vorübergehend und erfordern daher häufige Verabreichungen. Häufige Verabreichung dieser Inhibitoren und Blocker können die unerwünschten Nebenwirkungen weiter verschlimmern.
Kürzlich haben wir eine neue Strategie vorgeschlagen, die potenziell die Nebenwirkungen imZusammenhang mit aktuellen Medikamenten für die IBD-Behandlung 6 mildern oder sogar beseitigen kann. Diese Strategie verstärkt die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren Lymphgeweben6. Die Begründung dieser Strategie ist, dass Darm-Homing Treg Zellen speziell Heimat des Darms und wird daher nicht die systemische Immunabwehr gefährden. Da Treg-Zellen potenziell Gedächtnisbildenkönnen 7,8, Darm-Homing-Treg-Zellen können potenziell eine stabile Kontrolle der chronischen Darmentzündung bei IBD-Patienten bieten und damit sollte die Behandlung nicht so häufig verabreicht werden müssen. Da diese Strategie die Induktion von Darmhoming-Treg-Zellen in vivo verstärkt, hat sie nicht die Sorge der In-vivo-Instabilität in einer hochgradig proinflammatorischen Umgebung, die mit dem Adoptivtransfer von in vitro erzeugten Treg-Zellen9,10verbunden ist. In dieser Hinsicht sind in vitro erzeugte Treg-Zellen eine der vorgeschlagenen Strategien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen11,12,13 und Transplantatabstoßung14,15. Schließlich werden in dieser Strategie dendritische Zellen (DCs) entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen von zwei Molekülen de novo zu produzieren: aktives Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und aktives Vitamin A (Retinoinsäure oder RA). Wir haben uns für 1,25(OH)2D und RA entschieden, weil 1,25(OH)2D die Expression von regulatorischen Molekülen induzieren kann (z.B. Gabelstapler p3 [foxp3] und Interleukin-10 [IL-10])16,17 und dass RA die Expression von Darmhoming-Rezeptoren in T-Zellen stimulieren kann18. Da sowohl 1,25(OH)2D als auch RA auch DCs28,29tolerisieren können, gehen wir davon aus, dass die konstruierten DCs stabil in einem tolerogenen Status in vivo gehalten werden und damit die In-vivo-Instabilitätsbedenken umgehen, die mit in vitro erzeugten tolerogenen DCs (TolDCs)19,20,21verbunden sind. In dieser Hinsicht sind TolDCs auch eine der vorgeschlagenen Strategien für die In-vivo-Augmentation der Treg-Zellfunktionen19,20,21. Um unsere Argumentation zu unterstützen, haben wir gezeigt, dass die entwickelten DCs, nach in vivo Lieferung, die Induktion von Darm-homing Treg-Zellen in peripherenlymphoidenGeweben 6 erhöhen können.
Ein weiterer Vorteil unserer vorgeschlagenen Strategie ist, dass 1,25(OH)2D auch andere Funktionen hat, die IBD-Patienten potenziell zugute kommen können. Zu diesen anderen Funktionen gehört die Fähigkeit von 1,25(OH)2D, die Sekretion antimikrobieller Mittel zu stimulieren22 und die Karzinogenese23zu unterdrücken. Infektionen und Krebserkrankungen werden häufig mit IBD24,25assoziiert.
Um die DCs zu erzeugen, die lokal hohe Konzentrationen von 1,25(OH)2D und RA de novo erzeugen können, verwenden wir einen lentiviralen Vektor, um DCs zu entwickeln, um zwei Gene zu überexprimieren. Ein Gen ist das Cytochrom P450-Unterfamilie 27-Unterfamilie B-Mitglied 1 (CYP27B1), das 25-Hydroxyvitamin D 1-Hydroxylase (1-Hydroxylase) kodiert, das physiologisch die Synthese von 1,25(OH)2D katalysiert. Das andere Gen ist die Aldehyddehydrogenase 1 Familienmitglied A2 (ALDH1a2), die Retinaldehyddehydrogenase 2 (RALDH2) kodiert, die physiologisch die Synthese von RA6katalysiert.
Da die In-vivo-Augmentation der Darmhoming-Treg-Zellinduktion für die Behandlung von IBD potenziell wichtig ist, werden wir im folgenden Protokoll die Verfahren zur Erzeugung der 1-Hydroxylase-RALDH2-overexzierenden DCs (DC-CYP-ALDH-Zellen) kann für die zukünftige Untersuchung von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verwendet werden.
In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von DC-CYP-ALDH-Zellen zur Erweiterung der Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren lymphoiden Geweben. Unsere Daten haben gezeigt, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen lokal hohe Konzentrationen de novo von 1,25(OH)2D und RA in vitro in Gegenwart entsprechender Substrate (d.h. 25[OH]D bzw. Retinol) synthetisieren können. Da ausreichende Blutkonzentrationen von 25(OH)D und Retinol leicht durch Vitamin D- und A-Supplementierungen bei Patienten mit Defiziten<su…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Office of the Assistant Secretary of Defense for Health Affairs durch das Peer Reviewed Medical Research Program unter Auszeichnung Nr. W81XWH-15-1-0240 (XT). Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium gebilligt. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch Research Innovation Grants vom Department of Medicine der Loma Linda University (681207-2967 [XT und GG], 681205-2967 [XT] und 325491 [DJB]) unterstützt.
10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |