Summary

In Vivo Augmentazione dell'induzione delle cellule T regolatorie Gut-Homing

Published: January 22, 2020
doi:

Summary

Qui presentiamo un protocollo per l’aumento in vivo dell’induzione delle cellule T regolatorie gut-homing. In questo protocollo, le cellule dendritiche sono progettate per produrre localmente alte concentrazioni della vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e la vitamina attiva A (acido retinoico o RA) de novo.

Abstract

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica infiammatoria nel tratto gastrointestinale (GUT). Negli Stati Uniti, ci sono circa 1,4 milioni di pazienti con IBD. È generalmente accettato che una risposta immunitaria disregolata ai batteri intestinali avvia la malattia e interrompe la barriera epiteliale mucosale. Recentemente dimostriamo che le cellule T (Treg) regolatorie gut-homing sono una terapia promettente per l’IBD. Di conseguenza, questo articolo presenta un protocollo per l’aumento in vivo dell’induzione delle cellule Treg gut-homing. In questo protocollo, le cellule dendritiche sono progettate per produrre concentrazioni localmente elevate di due molecole de novo, vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e vitamina A attiva (acido retinoico o RA). Abbiamo scelto 1,25(OH)2D e RA sulla base di risultati precedenti che mostrano che 1,25(OH)2D possono indurre l’espressione di molecole regolatorie (ad esempio, box forcella P3 e interleucina-10) e che l’AR può stimolare l’espressione dei recettori gut-homing nelle cellule T. Per generare tali cellule dendritiche ingegnerizzate, utilizziamo un vettore lentivirale per traduciare le cellule dendritiche per sovraesprimere due geni. Un gene è il citocromo P450 famiglia 27 sottofamiglia B membro 1 che codifica 25-idrossivitamina D 1,idrossilasi, che catalizza fisiologicamente la sintesi di 1,25(OH)2D. L’altro gene è la dehydrogenasi di aldeide 1 membro della famiglia A2 che codifica la retinaldedeide dehydrogenasi 2, che catalizza fisiologicamente la sintesi dell’AR. Questo protocollo può essere utilizzato per future indagini sulle cellule Treg gut-homing in vivo.

Introduction

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica infiammatoria nel tratto gastrointestinale (GUT). Negli Stati Uniti, ci sono circa 1,4 milioni di pazienti con IBD. È generalmente accettato che una risposta immunitaria disregolata ai batteri intestinali avvia la malattia e interrompe la barriera epitelialemucosale 1,2. Per questo motivo, attualmente disponibili farmaci approvati U.S. Food and Drug Administration (FDA) inibiscono le funzioni dei mediatori infiammatori o bloccano l’homing delle cellule immunitarie nell’intestino. Tuttavia, i mediatori infiammatori e le cellule immunitarie che sono mirati sono necessari anche per le difese immunitarie. Di conseguenza, gli inibitori del mediatore infiammatorio compromettono la difesa immunitaria sistemica e i bloccanti dell’homing delle cellule immunitarie indeboliscono la difesa immunitaria intestinale, entrambe le quali possono portare a gravi conseguenze3,4. Inoltre, gli bloccanti delle cellule immunitarie possono anche bloccare l’homing delle cellule T (Treg) regolatorie nell’intestino e quindi possono peggiorare la tolleranza immunitaria intestinale già compromessa nei pazienti affetti da IBD. Inoltre, il blocco delle cellule di Treg homing nell’intestino può anche portare alla soppressione immunitaria sistemica a causa dell’accumulo di cellule Treg nel sangue5. Infine, gli inibitori e i bloccanti funzionano in modo transitorio e, di conseguenza, richiedono amministrazioni frequenti. La frequente somministrazione di questi inibitori e bloccanti può esacerbare ulteriormente gli effetti collaterali spiacevoli.

Recentemente, abbiamo proposto una nuova strategia che può potenzialmente mitigare o addirittura eliminare gli effetti collaterali associati ai farmaci attuali per il trattamento Con IBD6. Questa strategia aumenta l’induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici6. La logica di questa strategia è che le cellule Treg gut-homing specificamente casa per l’intestino e quindi non compromettere le difese immunitarie sistemiche. Inoltre, poiché le cellule Treg possono potenzialmente formare memoria7,8, cellule Treg gut-homing possono potenzialmente fornire un controllo stabile dell’infiammazione cronica dell’intestino nei pazienti Con IBD e, quindi, il trattamento non dovrebbe essere somministrato con la stessa frequenza. Inoltre, poiché questa strategia aumenta l’induzione delle cellule Treg gut-homing in vivo, non ha la preoccupazione di instabilità in vivo in un ambiente altamente proinfiammatorio che è associato con il trasferimento adottivo di cellule Treg generate in vitro9,10. A questo proposito, le cellule Treg generate in vitro sono una delle strategie proposte per il trattamento delle malattie autoimmuni11,12,13 e rigetto del trapianto14,15. Infine, in questa strategia, le cellule dendritiche (DC) sono progettate per produrre concentrazioni localmente elevate di due molecole de novo: vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e vitamina A attiva (acido retinoico o RA). Abbiamo scelto 1,25(OH)2D e RA perché 1,25(OH)2D possono indurre l’espressione di molecole regolatorie (ad esempio, forchetta box P3 [foxp3] e interleutra-10 [IL-10])16,17 e che l’AR può stimolare l’espressione dei recettori gut-homing nelle cellule T18. Poiché sia 1,25(OH)2D che RA possono anche tollerare i controller di dominio28,29, ragioniamo che i controller di dominio ingegnerizzati saranno mantenuti stabilmente in uno stato tolerogenico in vivo e quindi eludere le preoccupazioni inpresentisti che sono associate con DC tolerogeni generati in vitro (TolDC)19,20,21. A questo proposito, i TolDC sono anche una delle strategie proposte per l’aumento in vivo delle funzioni cellulari Treg19,20,21. Per sostenere il nostro ragionamento, abbiamo dimostrato che i CONTROLLER di dominio ingegnerizzati, al momento della consegna in vivo, possono aumentare l’induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici6.

Un ulteriore vantaggio della nostra strategia proposta è che 1,25(OH)2D ha anche altre funzioni che possono potenzialmente beneficiare i pazienti con IBD. Queste altre funzioni includono la capacità di 1,25(OH)2D per stimolare la secrezione di antimicrobici22 e per sopprimere la carcinogenesi23. Infezioni e tumori sono spesso associati con IBD24,25.

Per generare i CONTROLLER di dominio in grado di produrre concentrazioni locali elevate sia di 1,25(OH)2D che di RA de novo, utilizziamo un vettore lentivirale per progettare dc per sovraesprimere due geni. Un gene è il citocromo P450 famiglia 27 sottofamiglia B membro 1 (CYP27B1) che codifica 25-idrossivitamina D 1-idrossilasi (1-idrossislasi), che catalizza fisiologicamente la sintesi di 1,25(OH)2D. L’altro gene è l’aldeide dehydrogenasi 1 membro della famiglia A2 (ALDH1a2) che codifica retinaldeide dehydrogenasi 2 (RALDH2), che catalizza fisiologicamente la sintesi di RA6.

Poiché l’aumento in vivo dell’induzione delle cellule Treg gut-homing è potenzialmente importante nel trattamento dell’IBD, nel seguente protocollo ildettagliamo le procedure per la generazione dei DC inesprimibili 1-idrossilasi-RALDH2 (cellule DC-CYP-ALDH) che può essere utilizzato per la futura indagine sulle cellule Treg gut-homing in vivo.

Protocol

Tutti i protocolli di studio sugli animali in vivo sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l’uso istituzionale degli animali (IACUC) dell’Università di Loma Linda, nonché dall’Ufficio per la revisione della cura e l’uso degli animali (ACURO) del Comando per la ricerca medica e il materiel dell’esercito degli Stati Uniti (USAMRMC) Dipartimento della Difesa. 1. Preparazione del Lentivirus che esprime sia 1-idrossilasi e RALDH2 (lenti-CYP-ALDH Virus) Giorno 0: Al m…

Representative Results

Le cellule DC-CYP-ALDH hanno espresso una quantità significativamente aumentata di 1 -idrossisciosi. Per determinare se le cellule DC-CYP-ALDH generate da BMDC hanno espresso una quantità significativamente aumentata di 1- idrossiderosi, i BMCC sono stati transdotti con il virus lenticchie-CYP-ALDH per produrre cellule DC-CYP-ALDH derivate dal midollo osseo (cellule BMDC-CYP-ALDH). Successivamente, le cellule BMDC-CYP-ALDH sono state esaminate per l’espressione di 1 -idrossilasi da parte della FACS. I …

Discussion

In questo articolo viene descritto l’uso di cellule DC-CYP-ALDH, per aumentare l’induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici. I nostri dati hanno dimostrato che le cellule DC-CYP-ALDH possono sintetizzare localmente alte concentrazioni de novo sia di 1,25 (OH)2D e RA in vitro in presenza di substrati corrispondenti (cioè, 25[OH]D e retinolo, rispettivamente). Poiché sufficienti concentrazioni ematiche di 25(OH)D e retinolo possono essere facilmente raggiunte attraverso i supplemen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dall’Ufficio dell’Assistente Segretario della Difesa per gli Affari Sanitari attraverso il Peer Reviewed Medical Research Program sotto il premio N. . W81XWH-15-1-0240 (XT). Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelli dell’autore e non sono necessariamente approvati dal Dipartimento della Difesa. Questo lavoro è stato anche parzialmente sostenuto da Research Innovation Grants del Dipartimento di Medicina dell’Università di Loma Linda (681207-2967 [XT e GG], 681205-2967 [XT] e 325491 [DJB]).

Materials

10 mL syringes ThermoFisher Scientific Cat# 03-377-23
100 mm x 20 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430167
12-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-82
150 mm x 25 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430559
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) Sigma-Aldrich Cat# H4014
293T cells ATCC CRL-3216
2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
6-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-83
ALDEFLUOR kit Stemcell Technologies Cat# 01700
Anti-CYP27B1 Abcam Cat# ab95047
BD FACSAria II BD Biosciences N/A
CaCl2 Sigma-Aldrich Cat# C1016
CM-10-D cell culture medium DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-10-R cell culture medium RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-4-D cell culture medium DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430513
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430514
Dissecting scissor ThermoFisher Scientific Cat# 08-940
DMEM medium ThermoFisher Scientific Cat# 11960044
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific Cat# 16000044
Forceps ThermoFisher Scientific Cat# 22-327379
Gibco ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific Cat# A1049201
Glycerol Sigma-Aldrich Cat# G5516
Goat anti-rabbit IgG Abcam Cat# ab205718
HEPES Millipore Cat# 391340
Lenti-CYP-ALDH Custom-made 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.
L-glutamine ThermoFisher Scientific Cat#25030081
Lipopolysaccharide Sigma-Aldrich Cat# L3755
Murine GM-CSF Peprotech Cat# 315-03
Murine IL-4 Peprotech Cat# 214-14
Na2HPO4 Sigma-Aldrich Cat# NIST2186II
NaCl Sigma-Aldrich Cat# S9888
Needles ThermoFisher Scientific Cat# 14-841-02
Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
pCMVR8.74 Addgene Plasmid# 22036
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific Cat#15140148
Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
PMD2G Addgene Plasmid# 12259
Polypropylene tube, 15 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12500
Polypropylene tube, 50 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12502
Protamine sulfate Sigma-Aldrich Cat# P3369
Rabbit polycloncal IgG isotype control Abcam Cat# ab171870
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement Heartland Assays
RPMI 1640 medium, no glutamine ThermoFisher Scientific Cat# 21870076
Sodium pyruvat ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
Sorvall Legend XTR Centrifuge ThermoFisher Scientific Cat# 75004521
Sterile Cell strainers, 40 mm ThermoFisher Scientific Cat# 07-201-430
Sterile storage bottles, 500 mL ThermoFisher Scientific Cat# CLS431432

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Cite This Article
Bi, H., Wasnik, S., Baylink, D. J., Liu, C., Tang, X. In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction. J. Vis. Exp. (155), e60585, doi:10.3791/60585 (2020).

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