Questo protocollo consente una descrizione risolta nel tempo della crescita batterica in condizioni di stress a livello di popolazione a singola cellula e di popolazione cellulare.
L’analisi della capacità batterica di crescere e sopravvivere in condizioni di stress è essenziale per una vasta gamma di studi di microbiologia. È rilevante caratterizzare la risposta delle cellule batteriche a trattamenti che inducono stress come l’esposizione ad antibiotici o altri composti antimicrobici, irradiazione, pH non fisiologico, temperatura o concentrazione di sale. Diversi trattamenti di stress potrebbero disturbare diversi processi cellulari, tra cui la divisione cellulare, la replicazione del DNA, la sintesi proteica, l’integrità della membrana o la regolazione del ciclo cellulare. Questi effetti sono di solito associati a fenotipi specifici su scala cellulare. Pertanto, comprendere l’entità e la causalità della crescita indotta da stress o delle carenze di vitalità richiede un’attenta analisi di diversi parametri, sia a livello di singola cellula che a livello di popolazione. La strategia sperimentale qui presentata combina i tradizionali saggi di monitoraggio e placcatura della densità ottica con tecniche di analisi a singola cellula come la citometria del flusso e l’imaging della microscopia in tempo reale nelle cellule vive. Questo quadro multiscala consente una descrizione risolta nel tempo dell’impatto delle condizioni di stress sul destino di una popolazione batterica.
Lo scopo generale di questo protocollo è quello di analizzare il comportamento delle cellule batteriche esposte a trattamenti di stress a livello di popolazione e a livello di singola cellula. La crescita batterica e la vitalità sono tradizionalmente affrontate a livello di popolazione utilizzando il monitoraggio della densità ottica (OD600nm), che è un proxy di sintesi di massa cellulare batterica, o vacillando saggi per determinare la concentrazione di cellule vitali nella coltura (colonia che forma unità per millililatore, CFU/mL). In condizioni di crescita normali (non sollecitate), le misurazioni OD600nm e CFU/mL sono strettamente correlate perché il tempo di raddoppio batterico dipende direttamente dall’aumento di massa cellulare1,2. Tuttavia, questa correlazione viene spesso interrotta in condizioni che influenzano la sintesi di massa cellulare3, divisione cellulare4o che attivano la lisi cellulare. Un semplice esempio è fornito da trattamenti di stress che inibiscono la divisione cellulare, che portano alla formazione di cellule batteriche filamentose5,6. Le cellule filamentose si allungano normalmente perché la sintesi della massa cellulare non è influenzata, ma non sono in grado di dividersi in cellule vitali. La densità ottica di coltura aumenterà quindi nel tempo a un ritmo normale, ma non la concentrazione di cellule vitali determinata da saggi plating (CFU/mL). In questo caso, come in molti altri, la densità ottica e le misurazioni della placcatura sono informative, ma non riescono a fornire una comprensione completa dell’effetto indotto dallo stress osservato. Questi saggi di insieme devono essere combinati con tecniche di analisi a singola cellula per consentire una caratterizzazione approfondita delle carenze di crescita indotta dallo stress.
In questo caso, viene descritta una procedura che combina quattro approcci sperimentali complementari: (1) saggi di placcatura tradizionali e monitoraggio della densità ottica di base per monitorare la vitalità cellulare e la sintesi della massa cellulare, rispettivamente; (2) citometria di flusso per valutare le dimensioni delle cellule e parametri del contenuto di DNA su un gran numero di cellule; (3) imaging snapshot microscopia per analizzare la morfologia cellulare; e (4) l’imaging unicellulare time-lapse in camere microfluidiche per l’esame delle dinamiche temporali del destino cellulare. Questo quadro multiscala permette di interpretare gli effetti globali sulla crescita cellulare e la vitalità alla luce del comportamento delle singole cellule. Questa procedura può essere applicata per decifrare la risposta di diverse specie batteriche a qualsiasi stress di interesse, compresa la crescita in particolari condizioni (ad esempio, mezzo di crescita, pH, temperatura, concentrazione di sale) o l’esposizione a antibiotici o altri composti antimicrobici.
È essenziale prestare attenzione allo stato di crescita delle cellule durante la procedura. Far crescere le cellule su diverse generazioni prima di raggiungere una fase esponenziale completa. Per il successo di questo metodo, è importante che tutti i campioni di cellule vengano raccolti contemporaneamente ed è meglio analizzare solo una cultura trattata e una cultura non trattata contemporaneamente. I campioni cellulari per l’imaging microscopio devono essere mantenuti alla temperatura sperimentale per tutta la durata della procedura. È quindi essenziale preriscaldare la camera del microscopio e la camera microfluidica prima dell’inizio dell’esperimento. Se i campioni di cellule per la citometria di flusso non possono essere analizzati prontamente, possono essere conservati sul ghiaccio fino a 6 h. L’incubazione sul ghiaccio limiterà la crescita e la modifica morfologica delle cellule. In alternativa, l’utente potrebbe prendere in considerazione l’utilizzo della fissazione delle cellule in etanolo 75%, che di solito è raccomandato per la citometria di flusso10. Se il protocollo richiede il lavaggio dell’induttore di stress dal mezzo, centrifugare e le cellule pipetta molto attentamente per evitare di danneggiare le potenziali cellule aberranti.
Sia la citometria del flusso che l’analisi delle istantanee danno accesso alle dimensioni delle cellule e ai parametri del contenuto del DNA, con istantanee che forniscono un’ulteriore osservazione della morfologia cellulare. La colorazione del DNA con DAPI10 (4′,6-diamidino-2-phenylindole) o altri coloranti di DNA stabili può essere eseguita se non è disponibile alcuna fusione fluorescente per osservare i nucleoidi nell’organismo di interesse. Se non è possibile eseguire l’analisi della citometria di flusso, è importante immaginare e analizzare un gran numero di cellule mediante microscopia.
L’imaging a microscopia può essere eseguito anche utilizzando ceppi che trasportano fusioni fluorescenti alle proteine coinvolte in specifici percorsi di interesse. Questo aiuterebbe a rivelare l’effetto dello stress su una varietà di processi cellulari come la replicazione, la trascrizione, la sintesi della parete cellulare o la divisione cellulare. Il metodo può essere applicato a una serie di specie batteriche, l’unico requisito è che l’apparato microfluidico deve essere compatibile con la morfologia delle cellule. Le piastre microfluidiche standard sono utili per i batteri a forma di canna con una larghezza cellulare compresa tra 0,7 e 4,5 m. Tuttavia, cocci, ovococci o altri ceppi batterici con forme particolari devono essere testati. In alternativa, se non è possibile eseguire esperimenti microfluidici a causa dell’indisponibilità dell’apparecchiatura o di ceppi batterici incompatibili, l’imaging time-lapse può essere eseguito su vetrini montati su agarose per una durata massima di 2h.
Il vantaggio complessivo di questa analisi multiscala è quello di fornire una visione globale dell’effetto dell’induzione dello stress su diversi aspetti della capacità di crescita batterica (ad esempio, sintesi di massa, vitalità cellulare, morfologia cellulare, integrità della membrana, contenuto di DNA) e il modo questi si evolvono con il tempo in una popolazione batterica che cresce in condizioni di stress. Permette anche di analizzare il ripristino della crescita normale a livello di singola cellula e livello di popolazione. L’approccio è applicabile a un’ampia gamma di specie batteriche e praticamente a qualsiasi tipo di trattamento di stress, come l’esposizione a antibiotici o altri composti antimicrobici, l’analisi dell’influenza dell’interazione con altri organismi in multispecie o l’effetto della mutazione genetica.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano F. Cornet per aver fornito il ceppo hupA-mCherry, A. Dedieu per l’assistenza tecnica con la citometria e A. Ducret per l’aiuto con MicrobeJ. Finanziamenti: C. Lesterlin riconosce le istituzioni di Inserm e CNRS, nonché il programma ATIP-Avenir, la Schlumberger Foundation for Education and Research (FSER 2019), il finanziamento ANR per il programma di ricerca PlasMed (ANR-18-CE35-0008) e FINOVI per il finanziamento a J. Cayron; La Ligue contre le cancer per il finanziamento delle attrezzature del citometro di flusso. Contributi dell’autore: C.L. e J.C. hanno progettato la procedura e scritto il documento; J.C. ha eseguito gli esperimenti e analizzato i dati.
Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |