Dit protocol staat een tijd opgeloste beschrijving van bacteriële groei onder stressomstandigheden op de eencellige en de celpopulatie niveaus.
Analyse van het bacteriële vermogen om te groeien en te overleven onder stressomstandigheden is essentieel voor een breed scala van microbiologie studies. Het is relevant voor het karakteriseren van de respons van bacteriële cellen op stress-inducerende behandelingen zoals blootstelling aan antibiotica of andere antimicrobiële verbindingen, bestraling, niet-fysiologische pH, temperatuur, of zoutconcentratie. Verschillende stress behandelingen kunnen verschillende cellulaire processen verstoren, waaronder celdeling, DNA-replicatie, eiwitsynthese, membraan integriteit of regulering van de celcyclus. Deze effecten zijn meestal geassocieerd met specifieke fenotypes op de cellulaire schaal. Daarom, het begrijpen van de omvang en causaliteit van stress-geïnduceerde groei of levensvatbaarheid tekortkomingen vereist een zorgvuldige analyse van verschillende parameters, zowel op de single-cel en op het niveau van de bevolking. De experimentele strategie die hier wordt gepresenteerd combineert traditionele optische dichtheids bewaking en beplating assays met eencellige analysetechnieken zoals Flowcytometrie en real-time microscopische beeldvorming in levende cellen. Dit Multiscale-Framework maakt een Tijdopgeloste beschrijving mogelijk van de impact van stress condities op het lot van een bacteriële populatie.
Het algemene doel van dit protocol is om het gedrag van bacteriële cellen blootgesteld aan stress behandelingen bij de bevolking en op de eencellige niveaus te analyseren. Bacteriële groei en levensvatbaarheid worden traditioneel aangepakt op het niveau van de bevolking met behulp van optische dichtheid monitoring (OD600nm), dat is een proxy van bacteriële celmassa synthese, of door plating assays om te bepalen van de concentratie van levensvatbare cellen in de cultuur (kolonie vormende eenheid per milliliter, kve/ml). Onder normale (onbelaste) groeiomstandigheden zijn OD600nm en CFU/ml metingen strikt gecorreleerd omdat bacteriële verdubbelingstijd rechtstreeks afhangt van de toename van de celmassa1,2. Echter, deze correlatie wordt vaak verstoord onder omstandigheden die van invloed zijn op cel massa synthese3, cel divisie4, of die trigger cel lysis. Een eenvoudig voorbeeld wordt geleverd door stress behandelingen die celdeling remmen, wat resulteert in de vorming van filamenteeuze bacteriële cellen5,6. Filamenteuze cellen verlengen normaal, omdat celmassa synthese niet wordt beïnvloed, maar ze zijn niet in staat om te verdelen in levensvatbare cellen. De optische dichtheid van de cultuur zal dus in de loop van de tijd toenemen in een normaal tempo, maar niet de concentratie van levensvatbare cellen bepaald door beplating assays (kve/mL). In dit geval, zoals in vele andere, optische dichtheid en plating metingen zijn informatief, maar niet te bieden een uitgebreid begrip van de waargenomen stress-geïnduceerde effect. Deze ensemble-assays moeten worden gecombineerd met eencellige analysetechnieken om een diepgaande karakterisering van stress-geïnduceerde groei tekortkomingen mogelijk te maken.
Hier wordt een procedure beschreven die vier complementaire experimentele benaderingen combineert: (1) traditionele beplating assays en elementaire optische dichtheids bewaking om de levensvatbaarheid van de cel en de celmassa synthese te bewaken, respectievelijk; (2) Flowcytometrie om de celgrootte en de DNA-inhouds parameters op een groot aantal cellen te evalueren; (3) microscopie snapshot Imaging om celmorfologie te analyseren; en (4) time-lapse eencellige beeldvorming in microfluïdische kamers voor onderzoek van de temporele dynamiek van het lot van de cel. Dit Multi-Scale kader maakt het interpreteren van de wereldwijde effecten op celgroei en levensvatbaarheid in het licht van het gedrag van individuele cellen. Deze procedure kan worden toegepast om de respons van diverse bacteriesoorten op vrijwel elke stress van belang te ontcijferen, inclusief groei onder bijzondere omstandigheden (d.w.z. groeimedium, pH, temperatuur, zoutconcentratie) of blootstelling aan antibiotica of andere antimicrobiële verbindingen.
Het is essentieel om aandacht te besteden aan de groei toestand van de cellen tijdens de procedure. Kweek de cellen over meerdere generaties voordat u een volledige exponentiële fase bereikt. Voor het succes van deze methode, is het belangrijk dat alle cellen monsters tegelijkertijd worden verzameld, en het is het beste om slechts één behandelde en één onbehandelde cultuur op hetzelfde moment te analyseren. Celmonsters voor microscopie beeldvorming moeten gedurende de gehele procedure op de experimentele temperatuur worden gehandhaafd. Het is dan essentieel om vóór het begin van het experiment de Microscoop kamer en de microfluïdische kamer voor te verwarmen. Als celmonsters voor flow cytometrie niet gemakkelijk kunnen worden geanalyseerd, kunnen ze op ijs worden gehouden voor maximaal 6 uur. incubatie op ijs zal de groei en morfologische modificatie van de cellen beperken. Als alternatief kan de gebruiker overwegen fixatie van de cellen in ethanol 75% te gebruiken, wat meestal wordt aanbevolen voor flow flowcytometrieonderzoeken10. Als het protocol de stress-inductor van het medium moet wassen, centrifugeer en Pipetteer de cellen zeer zorgvuldig om beschadiging van de potentiële afwijkende cellen te voorkomen.
Beide Flowcytometrie en snapshot-analyse geven toegang tot de celgrootte en de parameters van DNA-inhoud, met snapshots die extra observatie van de celmorfologie bieden. DNA-kleuring met DAPI10 (4 ‘, 6-diamidino-2-fenylindole) of andere stabiele DNA-kleurstoffen kan worden uitgevoerd als er geen fluorescerende fusie beschikbaar is om de nucleoïden in het organisme van belang te observeren. Als een Flowcytometrie-analyse niet kan worden uitgevoerd, is het belangrijk om een groot aantal cellen te analyseren met microscopie.
Microscopie beeldvorming kan ook worden uitgevoerd met behulp van stammen die fluorescerende fusies uitvoeren naar eiwitten die betrokken zijn bij specifieke trajecten van belang. Dit zou helpen onthullen het effect van stress op een verscheidenheid van cellulaire processen zoals replicatie, transcriptie, celwandsynthese, of celdeling. De methode kan worden toegepast op een reeks bacteriesoorten, waarbij de enige eis is dat de microfluïdische apparatuur verenigbaar moet zijn met de morfologie van de cellen. Standaard microfluïdische platen zijn handig voor staafvormige bacteriën met een celbreedte tussen 0,7 μm en 4,5 μm. Echter, Cocci, ovococci, of andere bacteriële stammen met eigenaardige vormen moeten worden getest. Als de microfluïdische experimenten niet kunnen worden uitgevoerd als gevolg van het niet beschikbaar zijn van de apparatuur of onverenigbare bacteriestammen, kan timelapse-beeldvorming worden uitgevoerd op op agarose gemonteerde dia’s voor een maximale duur van 2h.
Het algemene voordeel van deze Multi-Scale analyse is het bieden van een globale visie van het effect van stress inductie op verschillende aspecten van bacteriële groeivermogen (d.w.z. massa synthese, levensvatbaarheid van cellen, celmorfologie, membraan integriteit, DNA-inhoud) en de manier waarop deze evolueren met de tijd in een bacterie populatie die onder stressomstandigheden groeit. Het maakt het ook mogelijk om het herstel van de normale groei op het niveau van de eencellige en de populatie te analyseren. De aanpak is van toepassing op een breed scala aan bacteriesoorten en op vrijwel elke vorm van stress behandeling, zoals blootstelling aan antibiotica of andere antimicrobiële verbindingen, analyse van de invloed van interactie met andere organismen in diepte populaties, of het effect van genetische mutatie.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken F. Cornet voor het leveren van de Hupa-mCherry stam, a. DeDieu voor technische bijstand met cytometrie, en a. Ducret voor hulp bij MicrobeJ. Financiering: C. Lesterlin erkent INSERM-en CNRS-instellingen, evenals het ATIP-Avenir-programma, de Schlumberger-Stichting voor onderwijs en onderzoek (FSER 2019), de ANR-financiering voor het Plasmaed onderzoeksprogramma (ANR-18-CE35-0008) en FINOVI voor financiering aan J. Cayron; La Ligue contre le Cancer voor de financiering van de flow cytometer-apparatuur. Bijdragen van de auteur: C.L. en J.C. ontwierp de procedure en schreef het papier; J.C. voerde de experimenten uit en analyseerde de gegevens.
Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |