该协议允许在单细胞和细胞群水平上对在应激条件下的细菌生长进行时间解析的描述。
分析细菌在压力条件下生长和生存的能力对于广泛的微生物学研究至关重要。描述细菌细胞对压力诱导治疗(如接触抗生素或其他抗菌化合物、辐照、非生理pH、温度或盐浓度)的反应是相关的。不同的应激处理可能会干扰不同的细胞过程,包括细胞分裂、DNA复制、蛋白质合成、膜完整性或细胞周期调节。这些影响通常与细胞规模的特定表型相关。因此,要了解压力引起的增长或生存能力不足的程度和因果关系,需要在单单元和人口一级仔细分析若干参数。这里提出的实验策略将传统的光学密度监测和电镀测定与单细胞分析技术相结合,如活细胞流细胞测量和实时显微镜成像。这种多尺度框架允许对压力条件对细菌种群命运的影响进行时间解析的描述。
该协议的总体目的是分析细菌细胞在种群和单细胞水平上受到应激处理的行为。细菌生长和生存能力传统上通过光密度监测(OD600nm)在种群一级处理,光学密度监测是细菌细胞质量合成的代理,或者通过电镀测定来确定培养物中活细胞的浓度(孔组形成单位每毫升,CFU/mL)。在正常(无压力)生长条件下,OD600nm和 CFU/mL 测量严格相关,因为细菌倍增时间直接取决于细胞质量增加1,2。然而,这种相关性经常在影响细胞质量合成3,细胞分裂4或触发细胞变变的条件下中断。一个简单的例子是由压力处理,抑制细胞分裂,导致形成丝状细菌细胞5,6。丝状细胞正常拉长,因为细胞质量合成不受影响,但它们无法分裂成活细胞。因此,培养光密度会以正常速率随时间增加,但不会增加电镀测定法(CFU/mL)确定的活细胞浓度。在这种情况下,与许多其他情况一样,光学密度和电镀测量信息丰富,但未能全面了解观察到的应力诱导效应。这些综合检测需要与单细胞分析技术相结合,以便对应力引起的生长缺陷进行深入的表征。
本文描述了一种结合四种互补实验方法的过程:(1)传统的电镀测定和基本光密度监测,分别监测细胞活力和细胞质量合成;(2)流式细胞测定,对大量细胞进行细胞大小和DNA含量参数评价;(3)显微镜快照成像分析细胞形态;(4)微流体室的延时单细胞成像,用于检查细胞命运的时间动力学。这种多尺度框架允许根据单个细胞的行为来解释全球对细胞生长和生存能力的影响。此过程可用于破译不同细菌物种对几乎所有感兴趣压力的反应,包括特定条件下的生长(即生长培养基、pH、温度、盐浓度)或接触抗生素或其他抗菌化合物。
在手术过程中,必须注意细胞的生长状态。在达到完全指数阶段之前,在几代人中生长细胞。为了这种方法的成功,必须同时收集所有细胞样本,最好同时分析一个经过处理的培养体和一种未经处理的培养体。显微镜成像的细胞样本必须在整个过程中保持在实验温度。然后,在实验开始前预热显微镜室和微流体室至关重要。如果流式细胞学的细胞样本不能轻易分析,它们可以在冰上保存长达6小时。在冰上孵育将限制细胞的生长和形态改变。或者,用户可以考虑使用乙醇75%的细胞固定,这通常推荐用于流式细胞测定10。如果协议要求清洗介质的应力电感,则离心机和移液器细胞会非常小心,以避免损坏潜在的异常细胞。
流式细胞学和快照分析都允许访问细胞大小和DNA含量参数,快照提供细胞形态的其他观察。如果没有荧光融合来观察感兴趣的生物体中的核素,可以使用DAPI 10(4’,6-diamidino-2-phenylindole)或其他稳定的DNA染料进行DNA染色。如果无法执行流式细胞学分析,则通过显微镜对大量细胞进行成像和分析非常重要。
显微镜成像也可以使用携带荧光融合的菌株对涉及特定兴趣途径的蛋白质进行。这将有助于揭示压力对各种细胞过程的影响,如复制、转录、细胞壁合成或细胞分裂。该方法可应用于一系列细菌,唯一的要求是微流体装置必须与细胞的形态相容。标准微流体板便于使用细胞宽度在 0.7 μm 和 4.5 μm 之间的棒状细菌。然而,需要测试球菌、奥沃科奇或其他具有特殊形状的细菌菌株。或者,如果由于设备不可用或细菌菌株不兼容而无法进行微流体实验,则可以在加玫瑰安装的幻灯片上进行延时成像,最长持续时间为 2 小时。
这种多尺度分析的总体优势是提供压力感应对细菌生长能力几个方面(即大规模合成、细胞活力、细胞形态、膜完整性、DNA含量)和途径的影响的全球视野。这些在压力条件下生长的细菌种群中随时间而进化。它还允许在单细胞水平和种群水平上分析正常生长的恢复。该方法适用于广泛的细菌种类和几乎任何类型的压力处理,如接触抗生素或其他抗菌化合物,分析与多物种中其他生物体相互作用的影响种群,或基因突变的影响。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢F.Cornet提供hupA-mCherry菌株,A.Dedieu提供细胞学技术援助,A.杜克雷特帮助MicrobeJ。资助:C. 莱斯特林承认Inserm和CNRS机构以及ATIP-Avenir项目、斯伦贝谢教育和研究基金会(FSER 2019)、ANR对PlasMed研究项目(ANR-18-CE35-0008)的资助以及FINOVI为J.Cayron提供资金;为流动细胞仪设备提供资金的拉利格癌症。作者投稿:C.L.和J.C.设计了程序并撰写了论文;J.C.进行了实验并分析了数据。
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CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
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MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |