プロミニニン-1+出生後マウス小脳由来幹細胞の精製
Summary
ここで実証されているのが、白物質幹細胞を出生後マウス小脳から精製、培養、分化するための効率的で費用対効果の高い方法です。
Abstract
ほとんどの小脳ニューロンは、すべての小脳興奮性グルタミン酸ニューロンを生成する菱唇ニッチと、深部小脳核を構成するニューロンである抑制性GABAergic Purkinje細胞を生成する心室領域ニッチの2つの胚性幹細胞ニッチから生じる。近年、第3の幹細胞ニッチは、心室領域ニッチから二次的な発芽領域として生じると述べられてきた。このニッチの細胞は、細胞表面マーカープロミニニン-1によって定義され、出生後小脳の開発白色物質に局在する。このニッチは、出生後に生成された小脳アストロサイトと共に後期生まれた分子層GABAergicインターニューロンを占めています。彼らの発達の役割に加えて、このニッチは神経変性および腫瘍形成への関与に関して翻訳的重要性を得ている。これらの細胞の生物学は、その精製のための効率的な技術の欠如のために解読することが困難であった。ここで実証されているのは、これらの出生後小脳幹細胞を精製、培養、および分化するための効率的な方法です。
Introduction
小脳は、自主的な動きを調整する主要な神経回路として長い間認識されてきた1.それは、運動出力を微調整し、運動を調整するように、周囲からのプロプリオセプティブ情報を含む神経軸の広いスワッシュからの入力を受け取る。最近では、同様の情報処理ネットワーク,2、3、43を使用する可能性を有して認知や感情の調節にも関与している2。4
成体小脳は、外側の小脳皮質と内白物質で構成される。これらの構造内に散在する深いイントレースレクラ核である。神経系の他の部分と同様に、小脳の発達は、このよく組織化された構造を生み出すために移行し、分化する多能性前駆細胞(幹細胞)の増殖によって駆動される。初期の開発(E10.5-E13.5)では、第4心室の周りの心室幹ニッチ,は、ベルクマングリア,5、6、7、86と共にGABAergicニューロン(すなわち、プルキンジェ細胞、ルガロ細胞、ゴルジ5細胞)を生成する。7
開発の後半(出生後第1週)において、菱唇の第2の幹細胞ニッチは、励起性顆粒ニューロン99、10、11、1210,11,12を生じさせるMATH1およびNestin発現前駆体を生成する。最近第三の幹細胞ニッチは13を説明した。これらの細胞は、プロミニン-1(CD133とも呼ばれる)を発現し、腸内および造血系14、15、16,15,16における幹細胞のサブセットを定義する膜スパン糖タンパク質である。生体内運命マッピングは、これらの幹細胞が出生後の最初の3週間の間に、アストロサイトと共に主要な分子層インターニューロン(すなわち、バスケット細胞および星状細胞)を生成することを示している。従来、これらの細胞をインビトロで研究することは困難であった従来の方法では、プロミニン-1染色12、13、17,13,17に依存する高価で時間のかかる技術(すなわち、蛍光活性化細胞選別[FACS])が必要であった。このプロトコルは、これらの幹細胞を容易に培養し、分化することができるこれらの幹細胞の単離のための免疫磁気ベースの方法を記述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロミニン1発現小脳幹細胞は、出生後の最初の3週間の間に将来の白質に存在する。彼らの増殖は、Purkinje細胞17によってサポートされるソニックヘッジホッグ経路によって厳密に制御される。これらの幹細胞/前駆細胞は、バスケット細胞および星状細胞と呼ばれる後生まれのGABAergicインターニューロンに寄与する。これらのインターニューロンは分子層に存在し、そこでそ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、彼らの提案のためのオパールラボのメンバーに感謝します.この作業は、NIH助成金1RO1 NS062051と1RO1NS08251(オパールP)によってサポートされました
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
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