Purificazione della Prominin-1- Cellule staminali dal cervelletto del topo postnatale
Summary
Dimostrata qui è un metodo efficiente ed economico per purificare, coltura e differenziare le cellule staminali della materia bianca dal cervelletto mureno postnatale.
Abstract
La maggior parte dei neuroni cerebellari derivano da due nicchie di sfiato embrionale: una nicchia di labbra trombica, che genera tutti i neuroni glutamateri eccunitori cerebellari, e una nicchia di zona ventricolare, che genera le cellule inibitorie GABAergic Purkinje, che sono neuroni che costituiscono i nuclei goneturari profondi e Bergman glia. Recentemente, è stata descritta una terza nicchia di cellule staminali che si presenta come una zona germinale secondaria dalla nicchia della zona ventricolare. Le cellule di questa nicchia sono definite dal marcatore di superficie cellulare promininin-1 e sono localizzate per lo sviluppo della materia bianca in via di sviluppo del cervelletto postnatale. Questa nicchia rappresenta lo strato molecolare nato tardivo gabAergic interneurons insieme agli astrociti cerebellari generati postinnatally. Oltre al loro ruolo di sviluppo, questa nicchia sta guadagnando importanza traslazionale per quanto riguarda il suo coinvolgimento nella neurodegenerazione e nella tumorigenesi. La biologia di queste cellule è stata difficile da decifrare a causa della mancanza di tecniche efficienti per la loro purificazione. Didimostrato qui sono metodi efficienti per purificare, coltura, e differenziare queste cellule staminali cerebellari postnatali.
Introduction
Il cervelletto è stato a lungo riconosciuto come un importante circuito neuronale che coordina il movimento volontario1. Riceve input dalle ampie fasce della neurosaxis, che include informazioni propriocettive dalla periferia, in modo da ottimizzare l’uscita del motore e coordinare il movimento. Più recentemente, è stato anche implicato nella regolazione della cognizione e delle emozioni utilizzando potenzialmente simili reti di elaborazione delle informazioni2,3,4.
Il cervelletto adulto è composto da una corteccia cerebellare esterna e materia bianca interna. Intralciati all’interno di queste strutture sono nuclei intraceri profondi. Simile al resto del sistema nervoso, lo sviluppo del cervelletto è guidato dalla proliferazione di cellule progenitrici multipotenti (cellule staminali) che migrano e si differenziano per produrre questa struttura ben organizzata. Nel primo sviluppo (E10.5–E13.5), una nicchia di stelo ventricolare intorno al quarto ventricolo in via di sviluppo genera neuroni GABAergic (cioè, cellule Purkinje, cellule Lugaro, cellule di Golgi) insieme a Bergmann glia5,6,77,8.
Più avanti nello sviluppo (settimana postnatale uno), una seconda nicchia di cellule staminali nel labbro rombico genera progenitori che esprimono MATH1 e Nestin che esprimono che danno origine a neuroni eccunetadi eccunitari9,10,11,12. Recentemente una terza nicchia di cellule staminali è statadescritta 13. Queste cellule esprimono promininin-1 (noto anche come CD133), una glicoproteina che definisce un sottoinsieme di cellule staminali nei sistemi intestinali ed ematopoietici14,15,16. La mappatura del destino in vivo mostra che queste cellule staminali generano interneuroni chiave dello strato molecolare (cioè le cellule del cesto e le cellule stellate), insieme agli astrociti, durante le prime tre settimane postnatali. In passato, è stato difficile studiare queste cellule in vitro perché i metodi precedenti hanno richiesto tecniche costose e dispendiose in termini di tempo (ad esempio, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza [FACS]) che dipendono dalla colorazione prominin-112,13,17. Questo protocollo descrive un metodo immunomagnetico per l’isolamento di queste cellule staminali che possono quindi essere facilmente coltivate e differenziate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule staminali cerebellari che esprimono promininina-1 risiedono nella futura materia bianca durante le prime 3 settimane di vita postnatale. La loro proliferazione è strettamente controllata dalla via del riccio sonico supportata dalle cellule Purkinje17. Queste cellule staminali/progenitori contribuiscono agli interneuroni GABAergici nati più tardi chiamati cellule del pancia e delle cellule stellate. Questi interneuroni risiedono nello strato molecolare, dove si sinsisizzano sulle cellu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Opal per i loro suggerimenti. Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni 1RO1 NS062051 e 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
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