Reinigung von Prominin-1+ Stammzellen aus postnatalem Maus-Zerebellum
Summary
Hier wird eine effiziente und kostengünstige Methode zur Reinigung, Kultur und Unterscheidung von Stammzellen aus weißer Materie von postnatalen Maus-Kleinhirnen demonstriert.
Abstract
Die meisten kleinhirnförmigen Neuronen entstehen aus zwei embryonalen Stammnischen: einer rhombischen Lippennische, die alle zwieslösenden erregenden glutamatergen Neuronen erzeugt, und einer ventrikulären Zonennische, die die hemmenden GABAerge Purkinje-Zellen erzeugt, die Neuronen sind, die die tiefen kleinhirnigen Kerne und Bergman-Glia bilden. Kürzlich wurde eine dritte Stammzellnische beschrieben, die als sekundäre Keimzone aus der ventrikulären Zonennische entsteht. Die Zellen dieser Nische werden durch den Zelloberflächenmarker Prominin-1 definiert und sind auf die sich entwickelnde weiße Materie des postnatalen Kleinhirns lokalisiert. Diese Nische ist für die spätgeborene molekulare Schicht GABAerge interneurons zusammen mit postnatal erzeugten Kleinhirn-Astrozyten. Neben ihrer Entwicklungsrolle gewinnt diese Nische hinsichtlich ihrer Beteiligung an Neurodegeneration und Tumorgenese an translationaler Bedeutung. Die Biologie dieser Zellen war aufgrund des Mangels an effizienten Techniken für ihre Reinigung schwer zu entziffern. Hier werden effiziente Methoden zur Reinigung, Kultur und Differenzierung dieser postnatalen Kleinhirnstammzellen demonstriert.
Introduction
Das Kleinhirn ist seit langem als ein wichtiger neuronaler Schaltkreis anerkannt, der die freiwillige Bewegung1koordiniert. Es erhält Input aus den weiten Schwaden der Neuroaxis, die propriozeptive Informationen aus der Peripherie enthält, um die Motorleistung zu optimieren und die Bewegung zu koordinieren. In jüngerer Zeit wurde es auch in die Regulierung von Kognition und Emotionen durch potenziell die Verwendung ähnlicher Informationsverarbeitungsnetzwerke2,3,4.
Das erwachsene Kleinhirn besteht aus einem äußeren Kleinhirnkortex und einer inneren weißen Materie. Zwischen diesen Strukturen sind tief intracerebellare Kerne. Ähnlich wie beim Rest des Nervensystems wird die Entwicklung des Kleinhirns durch die Proliferation multipotenter Vorläuferzellen (Stammzellen) angetrieben, die migrieren und differenzieren, um diese gut organisierte Struktur zu ergeben. In der frühen Entwicklung (E10.5–E13.5) erzeugt eine ventrikuläre Stammnische um den sich entwickelnden vierten Ventrikel GABAerge Neuronen (d.h. Purkinje-Zellen, Lugaro-Zellen, Golgi-Zellen) zusammen mit Bergmann glia5,6,7,8.
Später in der Entwicklung (postnatale Woche eins) erzeugt eine zweite Stammzellnische in der rhomben Lippe MATH1- und Nestin-exezigraphische Vorläufer, die zu erregenden Granulatneuronen9,10,11,12führen. Kürzlich wurde eine dritte Stammzellnische beschrieben13. Diese Zellen exprimieren Prominin-1 (auch bekannt als CD133), ein membranübergreifendes Glykoprotein, das eine Teilmenge von Stammzellen im Darm und hämatopoetischen Systemen14,15,16definiert. Die In-vivo-Schicksalskartierung zeigt, dass diese Stammzellen in den ersten drei postnatalen Wochen wichtige molekulare Schicht-Interneuronen (d. h. Korbzellen und stellate Zellen) zusammen mit Astrozyten erzeugen. In der Vergangenheit war es schwierig, diese Zellen in vitro zu untersuchen, da frühere Methoden kostspielige und zeitaufwändige Techniken (d. h. fluoreszaktivierte Zellsortierung [FACS]) erforderten, die von Prominin-1-Färbung12,13,17abhängig sind. Dieses Protokoll beschreibt eine immunmagnetische Methode zur Isolierung dieser Stammzellen, die dann leicht kultiviert und differenziert werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prominin-1-exättige Kleinhirnstammzellen befinden sich in den ersten 3 Wochen des postnatalen Lebens in der prospektiven weißen Materie. Ihre Proliferation wird durch den schallenden Igelweg, der von Purkinje-Zellen unterstützt wird, streng kontrolliert17. Diese Stammzellen/Vorläufer tragen zu später geborenen GABAergen Interneuronen bei, die Korbzellen und stellate Zellen genannt werden. Diese Interneuronen befinden sich in der molekularen Schicht, wo sie auf Purkinje-Zellen synapisieren und…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Opal-Labors für ihre Vorschläge. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien 1RO1 NS062051 und 1RO1NS08251 (Opal P) unterstützt.
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
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