Bu protokolün amacı Memeli gastrointestinal sistemde Candida albicans hücre şekli ve lokalizasyonu görselleştirmektir.
Candida albicans insanlarda ve diğer birçok memelilerde bağırsak mikrobiyotasının bir mantar bileşenidir. C. albicans en kolonize konaklarda semptomlara neden olmasa da, kommensal rezervuar bulaşıcı hastalık için bir depo olarak hizmet vermektedir, ve bağırsakta yüksek mantar titreleri varlığı inflamatuar barsak hastalığı ile ilişkilidir. Burada, kararlı gastrointestinal kolonizasyon bir fare modelinde C. albicans hücre morfolojisi ve lokalizasyon görselleştirmek için bir yöntem açıklar. Kolonizasyon oral antibiyotik ile tedavi edilmiş hayvanlarda C. albicans tek bir doz kullanılarak kurulmuştur. Bağırsak dokusu segmentleri luminal içeriği (mikroorganizmalar ve mukus) yanı sıra konak mukoza mimarisini koruyan bir şekilde sabitlenir. Son olarak, situ hibridizasyonfloresan C. albicans ve hyphae için leke mantar rRNA karşı problar kullanılarak yapılır. Bu protokolün önemli bir avantajı, Gastrointestinal kolonizasyon sırasında C. albicans hücre morfolojisi ve konak yapıları ile mekansal ilişki eşzamanlı gözlem sağlar.
Candida albicans bir mantar commensal yanı sıra fırsatçı bir insan patojen. Bu maya tanımlanmış bir çevresel niş yoksun ve bunun yerine gastrointestinal içinde yayılır (GI) sistem, cilt, ve insanlar ve diğer memelilerin genitoüriner sistem1. C. albicans üzerinde erken araştırma öncelikle virülans potansiyeli üzerinde duruldu oysa, birkaç yeni raporlar bağırsak içinde commensally yayılan organizmaların normal sağlık önemli roller oynayabilir düşündürmektedir, bağışıklık gelişimi de dahil olmak üzere ev sahibi2,3,4. Memeli bağırsağı içinde C. albicans commensalism araştırmalarını kolaylaştırmak için, istikrarlı GI kolonizasyon ve situ hibridizasyon bir floresan bir fare modeli geliştirdi (FISH) mantar maya hücreleri ve hyphae içinde görselleştirmek için tabanlı bir yöntem bağırsak lümeni.
Bazı istisnalar dışında5, laboratuvar da yetiştirilen fareler genellikle sindirim sisteminin mantar kolonizasyonuna direnç gösterirler. Kolonizasyon direnci belirli bakteri türleri tarafından aracılık olduğu düşünülmektedir; ancak, bu antibiyotik ile hayvanların tedavisi ile aşılabilir6,7 veya muhtemelen bakteri türlerinin bileşimi değiştirir kimyasal olarak tanımlanmış bir diyet kullanımı8,9. Benzer şekilde, insanlarda, geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı C. albicans overgrowth ve yayma ile ilişkili olmuştur10. Bizim murine kolonizasyon modeli c. albicans immünobeceriksiz, geleneksel olarak yetiştirilen farelerin kolonizasyonu kurmak için geniş spektrumlu antibiyotikler kullanır. Penisilin ve streptomisin c. albicans 108 koloni oluşturan birimleri (CPU) ile gavaj önce bir hafta boyunca hayvanların içme suyunda sağlanır. Antibiyotik li su devam ettikçe, C. albicans GI yolu boyunca yayılır ve 106−108 CPU/g dışkı titrelerine ulaşır. Mantar kolonizasyonunun yüksek seviyesine rağmen, hayvanlar sağlıklı kalır ve enfekte olmayan kontroller ile aynı oranda kilo. Bu model için ekran ve birden fazla C. albicans commensalism faktörler11karakterize başarıyla kullanılmıştır11 ,12.
Mantar krallığının diğer üyeleri gibi, C. albicans büyük morfolojik plastisite yeteneğine sahiptir13. In vitro koşullar altında, en az altı tek hücreli maya hücre türleri arasında geçiş gösterilmiştir, yanı sıra çok hücreli hyphae ve psödohyphae. Maya-to-hypha geçiş en iyi karakterize virülans özelliklerinden biridir, ve hyphae ve pseudohyphae en memeli hastalık modellerinde baskın, yanı sıra enfekte insan dokularında. Murine sindirim sistemi içinde C. albicans lokalizasyonu ve hücre morfolojisi belirlemek için, sabit histolojik kesitlerde maya ve hyphae boyama için bir FISH tekniği geliştirdi. Problar, mantar sitoplazması boyunca dağıtılan 23S ribozomal RNA (rRNA) ile melezlenen floresan etiketli DNA oligonükleotidlerinden oluşur. Konak dokular, ev sahibi mukoza, sindirim malzemesi, bakteriyel mikrobiyota ve bağırsak lümeni içindeki mukus da dahil olmak üzere bağırsağın üç boyutlu mimarisini koruyacak şekilde sabitolduğundan, bu teknik mantarın lokalizasyonuna izin verir. lekeli zaman bu yerler ile ilgili hücreler. FISH tekniği, Periyodik Asit Schiff (PAS) veya Gomori’nin Metheammine-Silver (GMS) gibi mantarlar için geleneksel histolojik lekeleri ile karşılaştırır, ayrıca ticari olarak mevcut antifungal antikorlar, çünkü bu reaktifler C. albicans. Ayrıca, standart fiksatifler mukus tabakası kaldırmak ve bağırsak lümen diğer içeriğini bozabilir14,15.
Bu makalede, yüksek dereceli C. albicans kolonize fare GI sistemi kurmak için ayrıntılı talimatlar sağlamak, ötanazi hayvanlardan sindirim sistemi diseksiyon için, luminal koruyan bir şekilde doku fiksasyonu için mimarisi ve FISH kullanarak ev sahibi dokular içinde C. albicans tespiti için. C. albicans yabani türü ve mutant suşları ek olarak, gavaj tekniği diğer mikroorganizmaların teslim etmek için kullanılabilir. Fiksasyon tekniği bağırsak içeriğinin korunması istenen herhangi bir çalışma için yararlı olacaktır. FISH prosedürü bir gün içinde tamamlanabilir ve birden fazla farklı etiketli problar kullanılarak birden fazla mantar türünü yerelleştirmek için kullanılabilir.
Burada açıklanan yöntem, herhangi bir cinsiyet veya zorlanma commensally kolonize farelerin GI yollarında C. albicans mayave hyphae görselleştirilmesi için izin verir. FISH sondası, mantar sitoplazması boyunca dağıtılan 23S rRNA ile melezleşir. Yöntemimiz bağırsak bakterileri görselleştirmek için daha önce bildirilen protokolden uyarlanmıştır20. C. albicans ana bilgisayar içinde morfolojisini değiştirdiğinden, yöntem mantar hücre şeklini ve yerelleştirmeyi izlemek için yararlıdır. Örneğin, bu yöntemi mayaların sindirim sistemi boyunca baskın olduğu hipotezini çürütmek ve bazı “filamentasyon-kusurlu” mutantların in vivo ve in vitro fenotipleri arasındaki tutarsızlıkları ortaya çıkarmak için kullandık12.
C. albicans commensal colonization için çeşitli fare modelleri mevcuttur. Laboratuvar fareleri ve insanların mikrobiyota ayrı ve, farelerde, antibiyotik kullanımı veya özel bir diyet istikrarlı kolonizasyon kurmak için gereklidir. Antibiyotik tedavisi de c. albicans insanların kolonizasyonu artırır ve yaygın hastalık için önemli bir risk faktörüdür10. Bu çalışmada kullanılan antibiyotikler nispeten ucuz ve bakteriyel mikrobiyota güvenilir düşüşler verim. Antibiyotikler intagonistik bakteri türlerinin yükünü azaltmak için kullanılan, hayvanlardan tüm bakterileri ortadan kaldırmak için değil unutmayın. Araştırmacılar C. albicansçalışma istiyorsanız- bakteri yokluğunda etkileşimleri barındırmak veya antibiyotik veya özel bir diyet kullanımı önlemek için, mikropsuz hayvanlar geleneksel yetiştirilen hayvanlar için ikame edilebilir; ancak, gnotobiyotik fareler bazı immün ve anatomik anormallikler sergilerler ve bu nedenle tüm amaçlar için uygun olmayabilir.
Başarılı FISH boyama için birkaç adım önemlidir: Önerilen fiksasyon yöntemi, özellikle mukus tabakası ve üç boyutlu gibi bağırsak lümeninin kırılgan içeriğini korumak için GI dokularının yapısal bütünlüğünü korumak için önemlidir. mantar ve bakteri organizasyonu16. Su içeren yaygın olarak kullanılan birçok fiksasyon çözümlerinin parlak mimariye son derece zarar verdiğini lütfen unutmayın. Bu protokolde önerilen fiksasyon sonrası yıkıntılar için fiksatifler ve çözümler su içermez ve su ile kirlenmeyi önlemek önemlidir. Bir diğer kritik adım ise hibridizasyon fırınındaki slaytların kuluçkaya yatışı sırasında hibridizasyon çözeltisinin buharlaşmasını önlemenin önemli olduğu hibridizasyon adımıdır. Bu sorunu önlemek için slaytları su geçirmez bir kapta yerleştirmenizi öneririz. Alternatif olarak, bir başlangıçta mikrodizilerin hibridizasyonu için kullanılan gibi su geçirmez hibridizasyon odaları kullanabilirsiniz.
Bir C. albicans-özelFISH probu bu protokolde açıklanmıştır. Ancak, birçok laboratuvar yetiştirilen fareler c. albicans veya diğer mantarlar kendi doğal bağırsak mikrobiyota bir parçası olarak içermediğinden, bir panfungal prob özellikle deneysel kolonize hayvanlarda C. albicans leke olabilir. Bir panfungal probun yerine üstün hibridizasyon özellikleri ve daha yüksek sinyal-gürültü oranı nedeniyle istenemeyebilir. Panfungal prob C. albicansiçin bir psödospesifik sonda olarak kullanılırsa, bu enfekte olmayan hayvanlarda boyama eksikliği belgelemek için önemlidir (yani, antibiyotik ile tedavi ama C. albicans). Kolonize olmayan bir kontrol hayvanının boyanması, FISH problarının gıda partiküllerine yapışmasından kaynaklanabilecek arka plan boyamalarını değerlendirmek için de yararlıdır. Genel olarak, FISH problarının kullanımı Calcofluor white (hücre tipleri arasında farklılık gösteren bir hücre duvarı bileşeni olan chitin, GMS veya ticari olarak mevcut antifungal antikorlar) gibi diğer boyama mantarları yöntemlerine göre gelişmiş özgüllük sunar. Ayrıca FISH boyama, türe özgü rRNA’lara farklı olarak etiketlenmiş FISH probları kullanarak birden fazla organizmanın costaining sağlar.
Bu tekniğin bir uyarı bazı C. albicans maya hücre tipleri FISH (örneğin, opak ve GUT hücre tipleri) tarafından çok benzer görünür olmasıdır. Bu hücre türleri arasında ayırt etmek için, hücre tipine özgü mantar mRNA’larına hibridizasyon probları geliştirmek yararlı olacaktır. Bununla birlikte, mevcut haliyle, FISH tekniği zaten in vivo ve in vitro davranışları arasında şaşırtıcı tutarsızlıklar ortaya koymuştur C. albicans mutantlar her iki koşul da altında değerlendirilen12, karmaşık etkileşimleri gösteren mevcut in vitro tahliller tarafından yeterince taklit olmayan doğal kommensal ortam. Ek yabani tip ve mutant konaklarda farklı C. albicans lekeleri daha fazla çalışmalar mantar-host etkileşimleri içine ek anlayışlar vermek olasıdır. Özellikle, inflamatuar barsak hastalığı modellerinde profil C. albicans öğretici olacaktır, hangi insanlarda C. albicans yüksek titreleri ile ilişkili21, ve C. albicans overgrowth ve hastalık diğer modelleri. FISH tekniği de belirli konak hücreleri leke immünohistochemistry ile kombine edilebilir. Genel olarak, burada sunulan yöntem memeli GI yolu içinde C. albicans lokalizasyonu ve morfolojisi belirlemek için makul hızlı ve güvenilir bir araç sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Carolina Tropini, Katharine Ng, Justin Sonnenburg ve KC Huang FISH tekniğini geliştirmede rehberlik için teşekkür etmek istiyorum. Teresa O’Meara el yazması hakkında yararlı yorumlar da yaptı ve Miriam Levy fotoğrafçılığa yardımcı oldu. Bu çalışma NIH’nin R01AI108992, R01DK1113788 ve Bulaşıcı Hastalıkların Patogenezinde Burroughs Hoş Geldiniz Ödülü ile desteklenmiştir.
1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
LB | can be substituted from any vendor | ||
Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
YEPD | can be substituted from any vendor |