Le but de ce protocole est de visualiser la forme et la localisation des cellules de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal des mammifères.
Candida albicans est une composante fongique du microbiote intestinal chez l’homme et de nombreux autres mammifères. Bien que C. albicans ne cause pas de symptômes chez la plupart des hôtes colonisés, le réservoir commensal ne servent de dépôt pour les maladies infectieuses, et la présence de seins fongiques élevés dans l’intestin est associée à une maladie inflammatoire de l’intestin. Ici, nous décrivons une méthode pour visualiser la morphologie et la localisation de cellules de C. albicans dans un modèle de souris de colonisation gastro-intestinale stable. La colonisation est établie à l’aide d’une seule dose de C. albicans chez les animaux qui ont été traités avec des antibiotiques oraux. Des segments de tissu intestinal sont fixés d’une manière qui préserve l’architecture du contenu luminal (micro-organismes et mucus) ainsi que la muqueuse hôte. Enfin, l’hybridation in situ fluorescente est effectuée à l’aide de sondes contre l’ARNr fongique pour tacher les C. albicans et les hyphes. Un avantage clé de ce protocole est qu’il permet l’observation simultanée de la morphologie cellulaire de C. albicans et de son association spatiale avec les structures hôtes pendant la colonisation gastro-intestinale.
Candida albicans est un commensal fongique ainsi qu’un agent pathogène humain opportuniste. Cette levure n’a pas de niche environnementale définie et se propage plutôt dans le tractus gastro-intestinal (GI), la peau et le tractus génito-urinaire des humains et d’autres mammifères1. Alors que les premières recherches sur C. albicans se sont concentrées principalement sur son potentiel de virulence, plusieurs rapports récents suggèrent que la propagation des organismes dans l’intestin peut jouer un rôle important dans la santé normale, y compris le développement immunitaire de la hôte2,3,4. Pour faciliter les investigations du commensalisme de C. albicans dans l’intestin des mammifères, nous avons développé un modèle de souris de colonisation stable de GI et une méthode d’hybridation in situ de fluorescence (FISH) pour visualiser des cellules de levure fongique et des hyphes dans le lumen intestinal.
À quelques exceptions près5, les souris de élevage en laboratoire présentent généralement une résistance à la colonisation fongique du tube digestif. On pense que la résistance à la colonisation est médiée par des espèces bactériennes spécifiques; cependant, ceci peut être surmonté par le traitement des animaux avec des antibiotiques6,7 ou l’utilisation d’un régime chimiquement défini qui modifie vraisemblablement la composition bactérienned’espèces 8,9. De même, chez l’homme, l’utilisation d’antibiotiques à large spectre a été associée à la surcroissance et à la diffusion de C. albicans 10. Notre modèle de colonisation murine utilise des antibiotiques à large spectre pour établir la colonisation de C. albicans de souris immunocompétentes et traditionnellement élevés. La pénicilline et la streptomycine sont fournies dans l’eau potable des animaux pendant une semaine avant le gavage avec 108 unités de formation de colonies (CUS) de C. albicans. Tant que l’eau infusée d’antibiotiques est continue, C. albicans se propagera à travers le tractus gastro-intestinal, atteignant les titers fécaux de 106à 108 CfU/g. Malgré le niveau élevé de colonisation fongique, les animaux restent en bonne santé et prennent du poids au même rythme que les témoins non infectés. Ce modèle a été utilisé avec succès pour dépister et caractériser plusieurs c. albicans commensalism facteurs11,12.
Comme d’autres membres du royaume fongique, C. albicans est capable d’une énorme plasticité morphologique13. Dans des conditions in vitro, il a été montré à la transition entre au moins six types de cellules de levure unicellulaires, ainsi que des hyphes multicellulaires et des pseudohyphes. La transition levure-hypha est l’un de ses attributs de virulence les mieux caractérisés, et les hyphes et les pseudohyphes prédominent dans la plupart des modèles de maladies des mammifères, ainsi que dans les tissus humains infectés. Pour déterminer la localisation et la morphologie de cellules de C. albicans dans le tube digestif murine, nous avons développé une technique de FISH pour colorer des levures et des hyphes dans les sections histologiques fixes. Les sondes se composent d’oligonucléotides d’ADN étiquetés fluorescents qui s’hybrident à l’ARN ribosomal fongique 23S (rRNA), qui est distribué dans tout le cytoplasme fongique. Parce que les tissus hôtes sont fixés d’une manière qui préserve l’architecture tridimensionnelle de l’intestin, y compris la muqueuse hôte, le matériel digestif, le microbiote bactérien, et le mucus dans le lumen intestinal, cette technique permet la localisation des champignons cellules par rapport à ces repères lorsqu’ils sont tachés. La technique FISH se compare favorablement aux taches histologiques traditionnelles pour les champignons, telles que le Schiff acide périodique (PAS) ou la méthénamine-Argent (GMS) de Gomori, ainsi que les anticorps antifongiques disponibles dans le commerce, parce que ces réactifs ne sont pas spécifiques pour C. albicans. En outre, les fixatifs standard enlèvent la couche de mucus et perturbent d’autres contenus de l’intestin lumen14,15.
Dans cet article, nous fournissons des instructions détaillées pour établir la colonisation de haute qualité de C. albicans du tractus gastro-intestinal de souris, pour la dissection du tube digestif des animaux euthanasiés, pour la fixation de tissu d’une manière qui préserve luminal pour la détection de C. albicans dans les tissus hôtes à l’aide de FISH. En plus des souches sauvages de type et mutant de C. albicans, la technique du gavage peut être utilisée pour fournir d’autres micro-organismes. La technique de fixation serait utile pour toute étude dans laquelle la préservation du contenu de l’intestin est souhaitée. La procédure FISH peut être complétée en un jour et peut être utilisée pour localiser plusieurs espèces fongiques à l’aide de multiples sondes étiquetées différemment.
La méthode décrite ici permet la visualisation des levures et des hyphes de C. albicans dans les voies gastro-intestinales des souris colonisées de n’importe quel sexe ou souche. La sonde FISH s’hybride à 23S rRNA, qui est distribué dans tout le cytoplasme fongique. Notre méthode a été adaptée d’un protocole précédemment rapporté pour visualiser des bactéries d’intestin20. Parce que C. albicans change sa morphologie au sein de l’hôte, la méthode est utile pour surveiller la forme des cellules fongiques ainsi que la localisation. Par exemple, nous avons utilisé cette méthode pour réfuter l’hypothèse selon laquelle les levures prédominent dans tout le tube digestif, et pour exposer les écarts entre les phénotypes in vivo et in vitro de certains mutants « défectueux de filamentation »12.
Plusieurs modèles de souris existent pour C. albicans commensal colonization. Le microbiote des souris de laboratoire et des humains est distinct et, chez la souris, l’utilisation d’antibiotiques ou d’un régime spécialisé est nécessaire pour établir une colonisation stable. Le traitement aux antibiotiques améliore également la colonisation de C. albicans de l’homme et est un facteur de risque majeur pour la maladie disséminée10. Les antibiotiques utilisés dans cette étude sont relativement peu coûteux et produisent des diminutions fiables du microbiote bactérien. Notez que les antibiotiques sont utilisés pour diminuer le fardeau des espèces bactériennes antagonistes, pas pour éliminer toutes les bactéries des animaux. Si les chercheurs souhaitent étudier les interactions C. albicans-hôteen l’absence de bactéries ou pour éviter l’utilisation d’antibiotiques ou d’un régime alimentaire spécial, les animaux exempts de germes peuvent être remplacés par des animaux élevés de façon conventionnelle; cependant, les souris gnotobiotiques présentent certaines anomalies immunitaires et anatomiques et peuvent donc ne pas convenir à toutes les fins.
Plusieurs étapes sont importantes pour la coloration FISH réussie: La méthode de fixation recommandée est essentielle pour préserver l’intégrité structurelle des tissus gastro-intestinaux, en particulier le contenu fragile de l’intestin lumen, tels que la couche de mucus et la tridimensionnelle l’organisation des champignons et des bactéries16. Veuillez noter que de nombreuses solutions de fixation couramment utilisées qui contiennent de l’eau sont très dommageables pour l’architecture lumineuse. Les fixatifs et les solutions pour les lavages post-fixation recommandés dans ce protocole ne contiennent pas d’eau, et il est important d’éviter la contamination par l’eau. Une autre étape critique est l’étape d’hybridation, où il est important d’éviter l’évaporation de la solution d’hybridation lors de l’incubation des toboggans dans le four d’hybridation. Nous vous suggérons de placer les diapositives dans un contenant étanche pour éviter ce problème. Alternativement, on peut utiliser des chambres d’hybridation étanches comme celles utilisées à l’origine pour l’hybridation des microréseaux.
Une sonde C. albicans-spécifique FISH est décrite dans ce protocole. Cependant, parce que beaucoup de souris d’élevage en laboratoire ne contiennent pas de C. albicans ou d’autres champignons dans le cadre de leur microbiote intestinal naturel, une sonde panfongique peut spécifiquement tacher C. albicans chez des animaux colonisés expérimentalement. La substitution d’une sonde panfunonique peut être souhaitable en raison de ses caractéristiques d’hybridation supérieures et de son rapport signal-bruit plus élevé. Si la sonde panfunonale est utilisée comme sonde pseudospécifique pour C. albicans, il est important de documenter un manque de coloration chez les animaux non infectés (c.-à-d., traités avec des antibiotiques, mais pas C. albicans). La coloration d’un animal témoin non colonisé est également utile pour évaluer la coloration de fond qui peut résulter de l’adhérence des sondes FISH aux particules alimentaires. Dans l’ensemble, l’utilisation de sondes FISH offre une spécificité accrue par rapport à la plupart des autres méthodes de coloration des champignons, comme le blanc Calcofluor (qui tache la chitin, un composant de la paroi cellulaire qui peut varier d’un type de cellule à l’autre), le GMS ou les anticorps antifongiques disponibles dans le commerce. En outre, la coloration FISH permet la costaining de plusieurs organismes à l’aide de sondes FISH étiquetées différemment pour les rARN spécifiques aux espèces.
Une mise en garde de cette technique est que certains types de cellules de levure C. albicans semblent très similaires par FISH (par exemple, les types de cellules opaques et GUT). Pour distinguer entre ces types de cellules, il serait utile de développer des sondes d’hybridation aux ARNm fongiques spécifiques au type cellulaire. Néanmoins, dans sa forme actuelle, la technique FISH a déjà révélé des écarts surprenants entre les comportements in vivo et in vitro des mutants de C. albicans évalués dans les deux conditions12, indiquant des interactions complexes dans le environnement commensal naturel qui ne sont pas suffisamment imités par les essais in vitro existants. D’autres études de différentes taches de C. albicans dans d’autres hôtes de type sauvage et mutants sont susceptibles de donner des informations supplémentaires sur les interactions fongiques-hôtes. En particulier, il sera instructif de profiler C. albicans dans les modèles de maladie sexiste inflammatoire, qui est associée à des seins élevés de C. albicans chez l’homme21, et d’autres modèles de C. albicans surcroissance et la maladie. La technique FISH peut également être combinée avec l’immunohistochimie pour tacher les cellules hôtes spécifiques. Dans l’ensemble, la méthode présentée ici fournit un moyen raisonnablement rapide et fiable pour déterminer la localisation et la morphologie de C. albicans dans le tractus gastro-intestinal des mammifères.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tient à remercier Carolina Tropini, Katharine Ng, Justin Sonnenburg et KC Huang pour leur orientation dans le développement de la technique FISH. Teresa O’Meara a fourni des commentaires utiles sur le manuscrit, et Miriam Levy a aidé à la photographie. Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH R01AI108992, R01DK113788, et un Burroughs Welcome Award dans la pathogenèse des maladies infectieuses.
1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
LB | can be substituted from any vendor | ||
Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
YEPD | can be substituted from any vendor |