该协议的目的是可视化念珠菌的细胞形状和定位在哺乳动物胃肠道。
念珠菌是人类和许多其他哺乳动物肠道微生物群的真菌成分。虽然C.白化病在大多数结肠宿主中不会引起症状,但共和储层确实是传染病的储存库,肠道中高真菌牙酸盐的存在与炎症性肠病有关。在这里,我们描述了一种在稳定的胃肠道殖民化小鼠模型中可视化C.白化病细胞形态和定位的方法。在用口服抗生素治疗的动物中,使用单剂量的C.白化素建立殖民化。肠道组织段固定的方式,保留发光成分(微生物和粘液)以及宿主粘膜的结构。最后,利用对真菌rRNA的探针进行荧光原位杂交,以染色C.白化病和hyphae。该协议的一个关键优点是,它允许同时观察C.白化病细胞形态及其在胃肠道殖民化期间与宿主结构的空间关联。
念珠菌是一种真菌性合成,也是一种机会性人类病原体。这种酵母缺乏一个明确的环境利基,而是在人类和其他哺乳动物的胃肠道(GI)道内传播,皮肤和泌尿生殖道1。虽然早期对白化球菌的研究主要侧重于其毒性潜力,但最近的几份报告表明,肠道内繁殖的生物体在正常健康中可能起重要作用,包括肠道的免疫发育。主机2,3,4。为了便于研究哺乳动物肠道内的C.白化病共性,我们开发了一种稳定的GI殖民化小鼠模型和基于原位杂交(FISH)的荧光杂交(FISH)方法,以可视化真菌酵母细胞和hyphae肠道流明。
除了一些例外5,实验室培育的小鼠通常表现出对消化道真菌殖民化的抵抗力。殖民化抵抗被认为是由特定的细菌物种介导的;然而,这可以通过用抗生素6、7治疗动物,或者使用化学定义的饮食来克服,这种饮食大概会改变细菌物种组成8、9。同样,在人类中,广谱抗生素的使用与白化动物的过度生长和传播有关10。我们的鼠殖民化模型使用广谱抗生素建立C.白化菌对免疫能力,常规饲养小鼠的殖民化。青霉素和链霉素在动物的饮用水中提供一周,在排泄前有108个菌群形成单位(CCFUs)。 只要继续注入抗生素的水,C. 白化菌就会通过胃肠道传播,达到10 6×108 CIFUs/g的粪便。尽管真菌殖民化程度很高,但动物仍然健康,体重增加的速度与未感染的对照相同。该模型已经成功地用于筛选和描述多种C.白化病共性因子11,12。
像真菌王国的其他成员一样,C.白化病具有巨大的形态可塑性13。在体外条件下,它已被证明在至少六个单细胞酵母细胞类型之间过渡,以及多细胞hyphae和伪海。酵母到催眠的转化是其最具特征的毒性属性之一,在大多数哺乳动物疾病模型中,以及受感染的人体组织中,hyphae和伪海菌占主导地位。为了确定甲酸白细胞在鼠消化道内的定位和细胞形态,我们开发了一种FISH技术,用于在固定组织学部分染色酵母和hyphae。探针由荧光标记的DNA寡核苷酸组成,该蛋白石杂交至真菌23S核糖体RNA(rRNA),分布在真菌细胞质中。由于宿主组织固定的方式,保留肠道的三维结构,包括宿主黏膜,消化材料,细菌微生物群,和粘液在肠道流明,这种技术允许真菌的定位细胞相对于这些地标染色。FISH 技术可与传统真菌组织染色相比,如周期性酸希夫 (PAS) 或 Gomori 的 Methenamine-Silver (GMS)以及市售的抗真菌抗体,因为这些试剂不特定于C. 白化。此外,标准固定剂去除粘液层,并破坏肠道流明14、15的其他内容物。
在本文中,我们提供了详细的说明,以建立高级C.白化菌殖民小鼠胃肠道,从安乐死动物的消化道解剖,组织固定的方式,保持发光架构,以及使用FISH检测宿主组织内的C.白化动物。除了野生型和突变菌株的C.白化,加维奇技术可用于提供其他微生物。固定技术对于任何需要保存肠道内容的研究都很有用。FISH 程序可在一天内完成,并可用于使用多个有差异标记的探针来本地化多个真菌物种。
此处描述的方法允许在任何性别或菌株的共体殖民小鼠的胃肠道中可视化C. albicans酵母和 hyphae。FISH探针杂交到23S rRNA,分布在真菌细胞质中。我们的方法是从先前报道的用于可视化肠道细菌20的协议改编的。由于C.albican在宿主中改变其形态,因此该方法可用于监测真菌细胞形状以及定位。例如,我们使用这种方法反驳了酵母在整个消化道中占主导地位的假设,并揭示了某些”纤维缺陷”突变体12的体内表型和体外表型之间的差异。
几种小鼠模型存在C.白化碱的合成殖民化。实验鼠和人类的微生物群是截然不同的,在小鼠中,需要使用抗生素或专门饮食来建立稳定的殖民化。抗生素治疗也增强了人类的白化病殖民化,是传播疾病10的主要危险因素。本研究中使用的抗生素价格相对便宜,在细菌微生物群中可可靠降低。请注意,抗生素用于减轻对抗性细菌物种的负担,而不是消除动物中的所有细菌。如果研究人员希望研究无细菌的白化病宿主相互作用,或避免使用抗生素或特殊饮食,无细菌动物可以替代常规饲养的动物;然而,诺生物菌小鼠表现出某些免疫和解剖异常,因此可能并不适合所有目的。
有几个步骤对于成功的FISH染色非常重要:推荐的固定方法对于保持胃肠道组织的结构完整性至关重要,尤其是肠道流明的脆弱内容,如粘液层和三维真菌和细菌的组织16。请注意,许多常用的含有水的固定解决方案对灯具结构具有极大的破坏力。本议定书中推荐的固定后处理液的固定剂和解决方案不含水,避免水污染非常重要。另一个关键步骤是杂交步骤,在杂交炉中孵育幻灯片期间避免杂交溶液蒸发非常重要。我们建议将幻灯片放在防水容器中,以避免此问题。或者,可以使用防水杂交室,如最初用于微阵列杂交的腔室。
本协议描述了一种C.白化亚比加特异性FISH探头。然而,由于许多实验室饲养的小鼠不含C.白化菌或其他真菌作为其天然肠道微生物群的一部分,泛真菌探针可能特别在实验殖民动物中染色C.白化动物。由于其优越的杂交特性和较高的信噪比,替代泛真菌探针可能是可取的。如果泛真菌探针被用作C.白化病的伪特异性探针,重要的是要记录未感染的动物(即,用抗生素治疗,而不是使用C.白化病)中缺乏染色。非殖民控制动物的染色也有助于评估因FISH探头与食物颗粒粘附而导致的背景染色。总体而言,FISH探针的使用为大多数其他染色真菌方法提供了增强的特异性,例如钙素白(染色甲素,一种细胞类型可能不同细胞的细胞壁成分)、GMS或市售的抗真菌抗体。此外,FISH 染色允许使用不同标记的 FISH 探针对物种特定的 rRNA 进行多种生物的贴迹。
这种技术的一个警告是,某些C.albicans酵母细胞类型与FISH非常相似(例如,不透明和GUT细胞类型)。为了区分这些细胞类型,开发细胞类型特定的真菌mRNA的杂交探针将是有益的。然而,以目前的形式,FISH技术已经揭示了在这两种情况下评估的C.albican突变体的体内和体外行为之间的惊人差异,表明在自然的合成环境,没有充分模仿现有的体外测定。进一步研究其他野生和突变宿主中不同C.白化菌的污渍,可能会对真菌-宿主相互作用产生更多的见解。特别是,在炎症性肠病模型中分析C.白化病具有指导意义,这种病与人类21种甲酸大病的高酸点子以及其他Model的白化病过度生长和疾病有关。FISH技术也可以与免疫组织化学相结合,染色特定的宿主细胞。总体而言,这里介绍的方法提供了一种相当快速可靠的方法来确定C.白化病在哺乳动物胃肠道内的定位和形态。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢卡罗莱纳·特罗比尼、凯瑟琳·吴、贾斯汀·松南堡和KC Huang在开发FISH技术方面的指导。特蕾莎·奥米拉对手稿提供了有益的评论,米里亚姆·利维协助摄影。这项工作得到了NIH授予R01AI108992、R01DK113788和传染病发病机制欢迎奖的支持。
1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
LB | can be substituted from any vendor | ||
Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
YEPD | can be substituted from any vendor |