ההשפעות של מעכבי migrastatic על הגירה התאים של סרטן glioma בתלת מימדי (3D) הפלישה אומר באמצעות המעכב deacetylase (HDAC) מתאפיין במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.
גילוי ופיתוח של תרופות בחקר הסרטן הוא יותר ויותר מבוסס על מסכי הסמים בפורמט 3D. מעכבי הרומן מיקוד הפוטנציאל הנדידה פולשנית של תאים סרטניים, וכתוצאה מכך התפשטות גרורתית של המחלה, מתגלים ונחשבים טיפולים משלימים סרטן פולשני מאוד כגון gliomas. לכן, יצירת נתונים המאפשרים ניתוחים מפורטים של תאים בסביבה תלת-ממדית לאחר הוספת תרופה נדרשת. המתודולוגיה מתוארת כאן, שילוב של הפלישה ספרואיד מספר עם לכידת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח נתונים על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ (CLSM), מאפשר אפיון מפורט של ההשפעות של מעכבי נגד נדידה הפוטנציאלי MI-192 על תאים glioma. Spheroids נוצרו קווי התא עבור בחני פלישה אומר ב מחסיד נמוך 96-טוב צלחות ולאחר מכן מוכן ניתוח clsm. זרימת העבודה המתוארת הייתה מועדפת על-ידי שימוש נפוץ אחרים ביצירת שיטות הייצור הנפוצות בשל הקלות והתוכסות. זה, בשילוב עם רזולוציית תמונה משופרת מושגת על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לעומת גישות רגילות שדה רחב, איפשר זיהוי וניתוח של שינויים מורפולוגיים ברורים בתאי נדידה בסביבה תלת-ממדית לאחר טיפול עם התרופה migrastatic MI-192.
שלוש טכנולוגיות ספרואיד ממדיות לגילוי תרופות טרום-קליניות ופיתוח תרופות לסרטן פוטנציאליות הן יותר ויותר להיות המועדף על מסכי סמים קונבנציונליים; כך, יש יותר פיתוח של migrastatic-הגירה ומניעת פלישה-סמים. הרציונל מאחורי ההתפתחויות האלה בטיפול בסרטן הם ברורים: 3d ספרואיד בחני מייצגים גישה מציאותית יותר לסינון תרופות נגד סרטן פוטנציאלי כפי שהם מחקים אדריכלות הגידול 3d בנאמנות יותר מאשר התרבויות התא דופלקס, באופן מדויק יותר, ולאפשר אפיון של פעילות התרופות בהגדרה הקשורה לגידול. בנוסף, עליית ההתנגדות לתרופות כימוחלות בסוגים רבים של סרטן ושיעורי מוות גבוה בקרב חולי סרטן בשל הפוטנציאל גרורות על ידי היכולת של תאים סרטניים להגר לאתרי גידול מרחוק תומך הכללה של סוכני כימותרפיות מיקוד הפוטנציאל הנדידה של תאים סרטניים כמו הטיפול שדון בעתיד סרטן קליני ניסויים1. זה במיוחד המקרה של סרטן פולשני מאוד, כגון glioblastomas בדרגה גבוהה (GBM). ניהול GBM כולל ניתוח, הקרנות, וכימותרפיה. עם זאת, גם עם טיפול משולב, רוב המטופלים מתדרדרות בתוך שנה 1 של אבחנה ראשונית עם הישרדות חציון של 11-15 חודשים2,3. התקדמות אדירה בתחום הטכנולוגיה 3D נעשו בשנים האחרונות: מערכות מיקרו, מבנים מפוברק ו 3D פיגומים, ומוסר הפרט השני הם השתפרו ללא הרף כדי לאפשר בדיקות שגרתיות בקנה מידה גדול4, 5,6,7. עם זאת, התוצאות שהתקבלו משיטות אלה חייבות להיות מנותח באופן משמעותי משום שפענוח הנתונים מפריע לעתים קרובות על-ידי ניסיונות לנתח נתונים שנוצרו על-ידי 3D עם מערכות ניתוח תמונה דו-ממדית.
למרות היותו עדיף במונחים של מהירות רכישת תמונה והפחתת רעילות התמונה, רוב מערכות השדה הרחב נשארות מוגבלות על ידי רזולוציה8. לפיכך, מלבד מידע לקריאה הקשורות ליעילות הסמים, השפעות מפורטות של פעולת התרופה על מבנים סלולריים תלת-ממדיים של תאים הגירה יאבדו באופן בלתי נמנע אם התמונה באמצעות מערכת שטח רחב. לעומת זאת, מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד (clsm) לוכדת באיכות גבוהה, תמונות מנות בצורה אופטית שניתן לשחזור ומעובד ב-3d לאחר הרכישה באמצעות תוכנת מחשב. כך, CLSM ישימה בקלות על הדמיה מורכבים 3D מבנים סלולריים, ובכך מאפשר חקירה של ההשפעות של מעכבי anti-migrastatic על מבנים תלת-ממד וניתוחים מעמיק של מנגנוני הגירה התא. זה ללא ספק ידריך בעתיד migrastatic התפתחות התרופה. כאן, מתוארת זרימת עבודה משולבת של דור כדורי, טיפול בתרופות, כתמים ואפיון על-ידי מיקרוסקופ קונטואיד ברזולוציה גבוהה.
הדרך הרומן ליצור spheroids תאים סרטניים לזיהוי של פעילות סמים migrastatic באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה גבוהה מתואר. השימוש בלוחות מסוכרנים נמוכים על פני טכניקות אחרות, כגון תליית טיפות15, הקלה על אמצעי ליצירת הספרואידים ומדים אחידים לשימוש הגירה קולגן הפלישה assays. הנקודות …
The authors have nothing to disclose.
היינו רוצים להודות לפרופסור כריס ג’ונס על שתרמה את קו הטלפון הKNS42. מיקרוסקופ zeiss LSM880 קונפוקלית וקד עם airyscan בשימוש בעבודה זו הוא חלק של חדשנות האדרספילד פרויקט דגירה (hiip) ממומן באמצעות העיר לידס באזור שותפות ארגוני (lep) עסקת צמיחה. קרדיט על תמונת המיקרוסקופ איור 3: מיקרוסקופ קרל Zeiss GmbH, microscopy@zeiss.com.
Collagen I, rat tail, 100 mg | Corning | 354236 | for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen. |
Coverslips | various | various | for microscopy imaging |
DMEM powder | Sigma | D5648 | needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use. |
Foetal calf serum | Sigma | F7524-500ML | needed for cell culture of glioma cell lines |
Glass slides | various | various | for microscopy imaging |
High glucose DMEM | Gibco | 41965062 | needed for cell culture of glioma cell lines |
Inhibitor | Tocris | various | various – according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results. |
Mountant | various | various | for microscopic imaging |
NaOH (1 M) | various | various | NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation. |
Paraformaldehyde | various | various | for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay |
Pastettes (graduated pipette, 3ml) | various | various | for invasion assay, solution removal |
PBS, sterile for tissue culture | Sigma | D1408-500ML | needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining |
Pen/strep (antibiotics) | Sigma | P4333 | needed for cell culture of glioma cell lines |
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin | various | various | there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500. |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration |
Trypsin | Sigma | T4049 | for trypsinisation |
Ultra low attachment plates | Sigma/Nunc | CLS7007-24EA | for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids |
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml) | various e.g. Costar | CLS4488-50; CLS4487-50 | for tissue culture and collagen preparation |
various multichannel (50 – 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL) | various | various | for cell and spheroid handling |
Widefield microscopy | various | various | for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific) |
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective | Zeiss | quote from manufacturer | Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop. |