Die Auswirkungen von migrastatischen Inhibitoren auf die Gliom-Krebszellmigration in dreidimensionalen (3D) Invasions-Assays mit einem Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDAC) sind durch eine hochauflösende konfokale Mikroskopie gekennzeichnet.
Die Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln in der Krebsforschung basiert zunehmend auf Medikamentenscreens im 3D-Format. Neuartige Inhibitoren, die auf das wandernde und invasive Potenzial von Krebszellen und damit auf die metastasierende Ausbreitung von Krankheiten abzielen, werden entdeckt und als ergänzende Behandlungen bei hochinvasiven Krebsarten wie Gliomen betrachtet. Daher ist die Generierung von Daten erforderlich, die die detaillierte Analyse von Zellen in einer 3D-Umgebung nach Zugabe eines Medikaments ermöglichen. Die hier beschriebene Methodik, die Sphäroid-Invasions-Assays mit hochauflösender Bilderfassung und Datenanalyse mittels konfokaler Laserscanmikroskopie (CLSM) kombiniert, ermöglichte eine detaillierte Charakterisierung der Auswirkungen des potenziellen Anti-Migrations-Inhibitors. MI-192 über Gliomzellen. Sphäroide wurden aus Zelllinien für Invasionstests in niedrig haftenden 96-Well-Platten erzeugt und dann für die CLSM-Analyse vorbereitet. Der beschriebene Workflow wurde aufgrund der Einfachheit und Reproduzierbarkeit gegenüber anderen häufig verwendeten Sphäroid-Erzeugungstechniken bevorzugt. In Kombination mit der verbesserten Bildauflösung, die durch konfokale Mikroskopie im Vergleich zu herkömmlichen Weitfeldansätzen erreicht wurde, ermöglichte dies die Identifizierung und Analyse unterschiedlicher morphologischer Veränderungen in Wanderzellen in einer 3D-Umgebung, Behandlung mit dem migrastatischen Medikament MI-192.
Dreidimensionale Sphäroid-Technologien für die präklinische Arzneimittelentdeckung und die Entwicklung potenzieller Krebsmedikamente werden zunehmend gegenüber herkömmlichen Arzneimittelscreens bevorzugt; daher gibt es mehr Entwicklung von migrastatischen — Migration und Invasionsprävention — Drogen. Die Gründe für diese Entwicklungen in der Krebsbehandlung sind klar: 3D-Sphäroid-Assays stellen einen realistischeren Ansatz für das Screening potenzieller Krebsmedikamente dar, da sie die 3D-Tumorarchitektur getreuer imitieren als Zellmonolayer-Kulturen, Wirkstoff-Tumor-Wechselwirkungen (Kinetik) genauer rekapitulieren und die Charakterisierung der Arzneimittelaktivität in einer tumorbedingten Umgebung ermöglichen. Darüber hinaus unterstützt der Anstieg der Resistenz gegen chemotoxische Medikamente bei vielen Krebsarten und die hohe Sterblichkeitsrate bei Krebspatienten aufgrund von Metastasen, die durch die Fähigkeit von Krebszellen potenziert werden, an entfernte Tumorstellen zu wandern, die Einbeziehung von Chemotherapeutika Ausrichtung auf das Migrationspotenzial von Krebszellen als adjuvante Behandlung in zukünftigen klinischen Krebsstudien1. Dies gilt insbesondere für hochinvasive Krebsarten wie hochgradige Glioblastome (GBM). GBM-Management umfasst Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie. Doch selbst bei einer Kombinationsbehandlung fallen die meisten Patienten innerhalb eines Jahres nach der Erstdiagnose mit einem medianen Überleben von 11-15 Monaten2,3zurück. In den letzten Jahren wurden enorme Fortschritte auf dem Gebiet der 3D-Technologie erzielt: Rotationssysteme, mikrofabrizierte Strukturen und 3D-Gerüste sowie andere Einzelprüfungen werden kontinuierlich verbessert, um Routinetests im großen Maßstab zu ermöglichen4, 5,6,7. Die ergebnisseweisen aus diesen Assays müssen jedoch sinnvoll analysiert werden, da die Dateninterpretation oft durch Versuche behindert wird, 3D-generierte Daten mit 2D-Bildanalysesystemen zu analysieren.
Obwohl die Bildaufnahmegeschwindigkeit und die reduzierte Fototoxizität bevorzugt sind, bleiben die meisten Breitfeldsysteme durch Auflösung8begrenzt. Abgesehen von Datenauslesungen im Zusammenhang mit der Wirksamkeit von Arzneimitteln gehen detaillierte Auswirkungen der Arzneimittelwirkung auf 3D-Zellstrukturen wandernder Zellen unweigerlich verloren, wenn sie mit einem Weitfeldsystem abgebildet werden. Umgekehrt erfasst die konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) hochwertige, optisch geschnittene Bilder, die in der 3D-Nacherfassung mit Computersoftware rekonstruiert und gerendert werden können. So ist CLSM leicht auf die Abbildung komplexer 3D-Zellstrukturen anwendbar und ermöglicht so die Abfrage der Auswirkungen von anti-migrastatischen Inhibitoren auf 3D-Strukturen und eingehende Analysen von Zellmigrationsmechanismen. Dies wird zweifellos als Richtschnur für die zukünftige Entwicklung migrastatischer Arzneimittel dienen. Hier wird ein kombinierter Workflow aus Sphäroiderzeugung, medikamentöser Behandlung, Färbeprotokoll und Charakterisierung durch hochauflösende konfokale Mikroskopie beschrieben.
Eine neue Möglichkeit, Krebszellsphäride zur Identifizierung der migrastatischen Arzneimittelaktivität mittels hochauflösender konfokaler Mikroskopie zu erstellen, wird beschrieben. Die Verwendung von niedrig haftenden Platten gegenüber anderen Techniken, wie hängende Tropfen15, hat ein Mittel zur Erzeugung reproduzierbarer und gleichmäßiger Sphäroide für den Einsatz in der Kollagenmigration und Invasion Assays erleichtert. Die kritischen Punkte in diesem Protokoll sind die Entfernung de…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Professor Chris Jones für den Beitrag zur KNS42-Zelllinie. Das Konfokalmikroskop Zeiss LSM880 mit AiryScan ist Teil des Huddersfield Innovation and Incubation Project (HIIP), das durch den Wachstumsdeal der Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) finanziert wird. Bild bildweise 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.
Collagen I, rat tail, 100 mg | Corning | 354236 | for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen. |
Coverslips | various | various | for microscopy imaging |
DMEM powder | Sigma | D5648 | needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use. |
Foetal calf serum | Sigma | F7524-500ML | needed for cell culture of glioma cell lines |
Glass slides | various | various | for microscopy imaging |
High glucose DMEM | Gibco | 41965062 | needed for cell culture of glioma cell lines |
Inhibitor | Tocris | various | various – according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results. |
Mountant | various | various | for microscopic imaging |
NaOH (1 M) | various | various | NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation. |
Paraformaldehyde | various | various | for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay |
Pastettes (graduated pipette, 3ml) | various | various | for invasion assay, solution removal |
PBS, sterile for tissue culture | Sigma | D1408-500ML | needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining |
Pen/strep (antibiotics) | Sigma | P4333 | needed for cell culture of glioma cell lines |
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin | various | various | there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500. |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration |
Trypsin | Sigma | T4049 | for trypsinisation |
Ultra low attachment plates | Sigma/Nunc | CLS7007-24EA | for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids |
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml) | various e.g. Costar | CLS4488-50; CLS4487-50 | for tissue culture and collagen preparation |
various multichannel (50 – 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL) | various | various | for cell and spheroid handling |
Widefield microscopy | various | various | for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific) |
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective | Zeiss | quote from manufacturer | Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop. |