Bu çalışmada embriyonik kök hücrelerden immün uyarıcı granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktörler taşıyan ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerin izole edilmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.
Embriyonik kök hücreler (ESC’ ler), kendini yenileyebilen ve her türlü embriyonik hücreye ayırabilen pluripotent kök hücrelerdir. Diğer birçok hücre tipi gibi, ESC’ler de ekzomlar gibi küçük membran vesiklelerini hücre dışı ortama bırakır. Ekzozomlar hücreler arası iletişimin temel arabulucuları olarak hizmet eder ve birçok (pato) fizyolojik süreçte temel bir rol oynar. Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) immün yanıtı modüle etmek için bir sitokin olarak işlev eder. Eksozomlarda GM-CSF varlığı, bağışıklık düzenleyici işlevlerini artırma potansiyeline sahiptir. Burada, GM-CSF, ES-D3 numaralı murine ESC hücre hattında bıçaklanarak aşırı ifade edildi. GM-CSF’yi aşırı ifade eden ES-D3 hücrelerinden yüksek kaliteli eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinleri (EV) izole etmek için bir protokol geliştirilmiştir. İzole ekzozom zenginleştirilmiş EV’ler çeşitli deneysel yaklaşımlarla karakterize edildi. Daha da önemlisi, eksozom zenginleştirilmiş EV’lerde önemli miktarda GM-CSF bulunduğu bulunmuştur. Genel olarak, ESC’lerden GM-CSF taşıyan ekzozom zenginleştirilmiş EV’ler, bağışıklık düzenleyici faaliyetlerini uygulamak için hücresiz veziküller olarak işlev görebilir.
ESC’ler preimplantasyon embriyosunun blastosist aşamasından türetilir1. Pluripotent kök hücreler olarak, ESC’ler her türlü embriyonik hücreye kendi kendini yenileme ve ayırt etme yeteneğine sahiptir. Olağanüstü gelişimsel potansiyelleri ve uzun vadeli proliferatif kapasiteleri nedeniyle, ESC’ler biyomedikal araştırmalar için son derece değerlidir1. Mevcut araştırma çalışmaları büyük ölçüde DIYABET, kalp hastalığı ve nörodejeneratif hastalıklar 2,3,4dahil olmak üzere çeşitli ana patolojik bozukluklar için ESC’lerin terapötikpotansiyelineodaklanmıştır.
ESC’ler de dahil olmak üzere memeli hücrelerinin hücre dışı ortama değişken boyutlarda veziküller salması bilinmektedir ve bu EV’ler hücreler arası iletişimdeki rolleri nedeniyle birçok fizyolojik ve patolojik işleve sahiptir5. EV’lerin farklı alt tipleri arasında, ekzozomlar, çeşitli hücre tiplerinden, ara endosit bölmelerin, çokvesiküler gövdelerin (MVB’ler) plazma membran6ile füzyonu üzerine hücre dışı boşluğa salınan küçük membran vezikülleridir. Ekzozomların hücreler arası iletişime aracılık yaptığı ve birçok (pato)fizyolojik süreçlerde kritik rol aldığı bildirilmiştir7,8. Ekzozomlar bazı biyolojik işlevleri kendi ebeveyn hücrelerinden miras alırlar, çünkü ekzozomlar proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere sitozolden elde edilen biyolojik malzemeler içerir. Bu nedenle, belirli bir hastalığa özgü immün yanıtı uyarıcı ilişkili antijenler veya faktörler, belirli hücre türlerinden ekzozomlarda kapsüllenir9. Bu, kanser önleyici bir aşı olarak tümör türevi ekzozomları araştıran klinik çalışmaların önünü açtı10.
GM-CSF, farklı bağışıklık hücreleri tarafından salgılanan bir sitokindir11. Ortaya çıkan kanıtlar, GM-CSF’nin bağışıklık sistemini aktive ettiğini ve düzenlediğini ve antijen sunma sürecinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir12. Örneğin, bir klinik rapor GM-CSF’nin tümörlere karşı bağışıklık tepkisini bir aşı adjuvan13olarak uyardığını göstermektedir. KLINIK DENEYLERDE GM-CSF’nin güçlü immün uyarıcı aktivitesini kullanmak için çeşitli GM-CSF tabanlı kanser immünoterapi stratejileri araştırılmıştır14. Bunlar arasında, ışınlanmış GM-CSF salgılayan tümör hücrelerinden oluşan bir kanser aşısı, metastazlı tümörlerde hücresel ve humoral antitümör yanıtları ve sonraki nekrozu indükleyerek ileri melanom hastalarında bazı vaatlerde bulundu15.
ESC’lerden elde edilen ekzozomlar orijinal ESC’lerle benzer biyolojik aktivitelere sahip olduğundan, belki ESC’lerden GM-CSF taşıyan ekzozomlar bağışıklık tepkisini düzenlemek için hücresiz veziküller olarak işlev görebilirim. Bu makalede, GM-CSF’yi ifade eden ESC’lerden yüksek kaliteli eksozom zenginleştirilmiş EV’ler üretmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmıştır. Bu ekzozomla zenginleştirilmiş EV’ler, bağışıklık tepkisini modüle etmek için bağışıklık düzenleyici veziklinler olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.
Bu çalışma, ekozomla zenginleştirilmiş EV’lerin bağışıklık modülatörü etkilerini incelemek için sunulabilen bağışıklık uyarıcı protein GM-CSF’yi taşıyan ekzozom bakımından zenginleştirilmiş EV’ler üretmek için son derece verimli bir yöntem göstermektedir. Çeşitli çalışmalar ekzomların bağışıklık düzenleyici ve anti-tümör fonksiyonları sergilediğini göstermektedir22. Bu nedenle, GM-CSF’yi ifade eden ESC’lerden gelen ekzozomlar da bağışıklık yanı…
The authors have nothing to disclose.
İletim elektron mikroskop görüntülerini elde eden Arkadiusz Slusarczyk ve Kentucky Biyomedikal Araştırma Altyapı Ağı’na (KBRIN, P20GM103436) minnettarız. Bu çalışma kısmen NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 ve CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) ve Free to Breathe Research Grant (K.Y.) hibeleri ile desteklendi.
Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |