Это исследование описывает метод выделения из эмбриональных стволовых клеток, обогащенных экзосомами внеклеточных везикул, несущих иммуностимулирующие колониестимулирующие факторы гранулоцитарных макрофагов.
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, способные к самообновлению и дифференцировке во все типы эмбриональных клеток. Как и многие другие типы клеток, ESCs высвобождают небольшие мембранные везикулы, такие как экзосомы, во внеклеточную среду. Экзосомы служат важнейшими медиаторами межклеточной коммуникации и играют основную роль во многих (пато)физиологических процессах. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) функционирует как цитокин для модуляции иммунного ответа. Присутствие GM-CSF в экзосомах может повысить их иммунорегукрепительную функцию. Здесь GM-CSF стабильно переэкспрессировался в мышиной клеточной линии ESC ES-D3. Был разработан протокол для выделения высококачественных экзосомных внеклеточных везикул (EV) из клеток ES-D3, чрезмерно экспрессировающих GM-CSF. Изолированные экзосомные ev были характеризованы различными экспериментальными подходами. Важно отметить, что было обнаружено, что значительное количество GM-CSF присутствует в обогащенных экзосомами EV. В целом, обогащенные ГМ-CSF экзосомами EV из ЭСК могут функционировать как бесклеточные везикулы для осуществления своей иммунорегуляторной деятельности.
ESCs получены из стадии бластоцисты предимплантационного эмбриона1. Как плюрипотентные стволовые клетки, ESCs обладают способностью самообновляться и дифференцироваться в любой тип эмбриональных клеток. Благодаря своему замечательному потенциалу развития и долгосрочной пролиферативной способности, ЭСЦ чрезвычайно ценны для биомедицинских исследований1. Текущие исследовательские усилия в основном сосредоточены на терапевтическом потенциале ESCs для различных основных патологических расстройств, включая диабет, болезни сердца и нейродегенеративные заболевания2,3,4.
Известно, что клетки млекопитающих, включая ЭСК, высвобождают везикулы с переменными размерами во внеклеточную среду, и эти EV обладают многими физиологическими и патологическими функциями из-за их роли в межклеточной связи5. Среди различных подтипов EV экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы, высвобождаемые из различных типов клеток во внеклеточное пространство при слиянии промежуточных эндоцитарных компартментов, мультивезикулярных тел (MVB), с плазматической мембраной6. Сообщалось, что экзосомы опосредовывают межклеточную коммуникацию и критически участвуют во многих (пато)физиологических процессах7,8. Экзосомы наследуют некоторые биологические функции от своих собственных родительских клеток, потому что экзосомы содержат биологические материалы, полученные из цитозола, включая белки и нуклеиновые кислоты. Таким образом, ассоциированные антигены или факторы, стимулирующие иммунный ответ, специфичный для данного заболевания, инкапсулируются в экзосомах из определенных типов клеток9. Это проложило путь к клиническим испытаниям, изучающим экзосомы, полученные из опухолей, в качестве противораковой вакцины10.
GM-CSF представляет собой цитокин, секретируемый различными типами иммунных клеток11. Новые данные свидетельствуют о том, что GM-CSF активирует и регулирует иммунную систему и играет важную роль в антиген-презентационно-презентационном процессе12. Например, клинический отчет предполагает, что GM-CSF стимулирует иммунный ответ на опухоли в качестве адъюванта вакцины13. Несколько стратегий иммунотерапии рака на основе GM-CSF для использования мощной иммуностимулирующей активности GM-CSF были исследованы в клинических испытаниях14. Среди них противораковая вакцина, состоящая из облученных ГМ-CSF-секреторных опухолевых клеток, показала некоторые перспективы у пациентов с прогрессирующей меланомой, индуцируя клеточные и гуморальные противоопухолевые ответы и последующий некроз в метастазированных опухолях15.
Поскольку экзосомы, полученные из ESCs, обладают аналогичной биологической активностью, что и исходные ESCs, возможно, экзосомы, несущие GM-CSF из ESCs, могут функционировать как бесклеточные везикулы для регулирования иммунного ответа. В данной работе описан подробный способ получения высококачественных обогащенных экзосомами EV из ЭСК, экспрессивующих GM-CSF. Эти обогащенные экзосомами электромобили могут служить иммунорегуляционными везикулами для модуляции иммунного ответа.
Это исследование показывает высокоэффективный метод производства обогащенных экзосомами EV, несущих иммуностимулирующий белок GM-CSF, который может быть использован для изучения иммуномодулирующих эффектов обогащенных экзосомами EV. Несколько исследований показывают, что экзосомы про?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны г-ну Аркадиузу Слюсарчику и Сети биомедицинских исследований Кентукки (KBRIN, P20GM103436) за получение изображений просвечивающих электронных микроскопов. Эта работа была частично поддержана грантами NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 и CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) и Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |