70%部分肝切除術とアセトアミノフェンを組み合わせた急性肝不全ラットモデルの生成
Summary
現在の研究で開発された急性肝不全動物モデルは、潜在的な治療法の研究のための実行可能な代替手段を提示します。現在のモデルは物理的および薬物誘発性肝障害の結合効果を採用し、新しい療法の可能性を研究するために適切な時間枠を提供する。
Abstract
急性肝不全(ALF)は、代謝、生化学的、合成、および肝臓の解毒機能の喪失をもたらす様々な病因によって引き起こされる臨床状態である。ほとんどの不可逆的な肝臓障害の場合, 直交異方性肝移植 (OLT) 唯一の利用可能な治療法.ALFの治療の治療可能性を研究するには、ALFの動物モデルにおけるその以前の試験が不可欠である。現在の研究では、ラットのALFモデルは、70%の部分肝切除術(PHx)と48時間の治療ウィンドウを提供するアセトアミノフェン(APAP)の注射を組み合わせることによって開発されました。肝臓の中央および左横葉を除去して肝臓塊の70%を切除し、APAPは2日間手術後に24時間与えられた。ALF誘発動物の生存率は著しく低下することが分かった。ALFの発症は、酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アルカリホスファターゼ(ALP)の血清レベルを変化させることによって確認された。プロトロンビン時間(PT)の変化;国際正規化比(INR)の評価。qPCRによる遺伝子発現プロファイルの研究は、アポトーシス、炎症、および肝障害の進行に関与する遺伝子の発現レベルの増加を明らかにした。肝細胞の拡散変性および免疫細胞の浸潤は、組織学的評価によって観察された。ALFの可逆性は、同系健康ラット肝細胞の脾臓内移植後のALT、AST、およびALPの生存および血清レベルの回復によって確認された。このモデルはALFの病態生理学を研究し、ALFのための新しい療法の可能性を評価するために利用できるALF動物モデルに信頼できる代わりを提示する。2つの異なるアプローチの使用はまた、物理的および薬物誘発性肝障害の組み合わせ効果を研究することを可能にする。現在のプロシージャの再現性と実現可能性は、モデルの追加の利点です。
Introduction
急性肝不全(ALF)は、米国肝疾患研究協会によって、損傷の事前徴候なしに急性肝障害の急速な発症として定義され、肝臓1の合成、代謝、および解毒機能の重度の障害によって特徴付される。ALFは、長期間にわたる肝障害の結果として障害が生じる慢性肝不全と、慢性肝疾患2、3、4の結果として突然の肝障害が起こる急性慢性肝不全(ACLF)とは異なる。ALFの唯一の治療法は、オルソトピック肝臓移植(OLT)であり、または死亡が起こる可能性がある。肝臓ドナーの不足のために、ALFに罹患している患者の死亡率は非常に高いです。
代替治療アプローチの可能性を研究し、ALFの病態生理学をよりよく理解するためには、ヒトで起こっているALFを反映できる動物モデルが必要である。すでに利用可能なALF動物モデルの多くには、いくつかの欠点があります。アセトアミノフェン(APAP)効果は再現が困難ですが、時間的、臨床的、生化学的、および病理学的パラメータの点で最も近い類似点を有する。APAP誘導動物モデルは、APAPおよびその中間体5、6、7によるヘモグロビンの酸化によって引き起こされるメトヘモグロビン血症の存在による問題にしばしば遭遇する。もう一つの問題は、予測不可能な用量応答と死亡時によって反映される再現性の欠如である。四塩化炭素(CCl4)を用いて製造されたALF動物モデルは、再現性が悪い8、9、10、11である。コンカバリンA(Con A)およびリポプリ糖(LPS)誘発ALF動物モデルは、自己免疫性肝疾患に関与する細胞機構の研究および敗血症の研究においてそれぞれ12、13、14、15に有利であるが、ヒト疾患の臨床パターンを反映していない。同様に、チオアセトアミド(TAA)はまた、活性代謝産物チオアセトアミドスルホキシドへの生体変換を必要とし、種変動16、17、18、19を示す。D-ガラクトサミン(D-Gal)は、ALFに類似した生化学的、代謝的、および生理学的変化を生じるが、ALF病理学的状態20、21、22、23全体を反映することができない。より良い方法でALF症候群を反映することができるALFモデルを開発するために、これらの方法の2つ以上を組み合わせる試みはほとんどありませんでした13.したがって、疾患パラメータを反映し、より良い再現性を有し、治療介入の効果を研究するのに十分な時間を提供するモデルを開発するためにさらなる研究が必要である。
現在の研究では、ラットの代替ALFモデルは、肝毒性試薬の部分肝切除術(PHx)と低用量の効果を組み合わせることによって作成されています。APAPは、肝臓の損傷を引き起こす上で確立された役割を持っています5,24,25.これは広く使用されている鎮痛薬であり、有毒な代謝産物を形成することによって、上剤用量で肝臓に有毒です.APAPは先進国で多くの死亡の原因です。部分肝切除術によって引き起こされる身体的傷害は、炎症および肝臓再生に関与する様々なプロセスの活性化を開始する。肝毒性剤APAPの注射は、肝臓に敵対的な環境を引き起こし、肝細胞の増殖を防ぐ。これは、ヘパトトキシンのより小さな用量と組み合わせると、手順のより良い再現性につながる動物のストレス期間を減少させます。そこで、このモデルを用いて、2種類の肝損傷の組み合わせ効果が検討されている。開発されたALF動物モデルを特徴付けるために、生理学的および生化学的パラメータが研究されている。ALFの可逆性の成功は、合成健康ラット肝細胞の移植によって確認された。
Protocol
以下に説明する手順は、ニューデリー国立免疫学会の動物倫理委員会によって承認されています。承認のシリアル参照番号は IAEC#355/14 です。 1. 準備 Das B et al.26によって前述したように外科的処置の準備をする。 体重が200~250gの6~8週齢の近親交配ウィスターラットを使用します。 標準的な動物のケア条件の下で動物を収容し、手順…
Representative Results
ALFの動物モデルにおける生存率70%PHxと組み合わせてALFを引き起こすAPAPの最適な用量は、750 mg/kgの体重として標準化された。治療レジメンは、動物が手術から完全に回復した70%PHxの後に24時間開始し、24時間間隔で2つのAPAP用量から構成された。死亡率は、APAPの2回目の投与後80%の割合で観察され、48時間後の手術後に観察された。生存率を分析し、カプランマイヤー法を使用し?…
Discussion
ALFのための適切な動物モデルの開発は、病因およびALFの進行のより良い理解のために最も重要である。よく特徴付けられたALF動物モデルはまたALFに対する新しい治療アプローチの開発および試用のための機会を提供する。ALF6,12,21,23,46,47,48</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、インド政府バイオテクノロジー省からニューデリー国立免疫学研究所に寄せられたコア補助金によって支援されました。
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
Cite This Article
Sahay, P., Jain, K., Sinha, P., Das, B., Mishra, A., Kesarwani, A., Sahu, P., Mohan, K. V., Kumar, M. M., Nagarajan, P., Upadhyay, P. Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen. J. Vis. Exp. (153), e60146, doi:10.3791/60146 (2019).