Summary

Bloqueo de anticuerpos dirigido por un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y méticos Fc-III (DCAF)

Published: September 17, 2019
doi:

Summary

El desarrollo de un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y miméticos Fc-III (DCAF) es novedoso para la eliminación de anticuerpos dañinos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la síntesis de la molécula DCAF1, que puede bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para eliminar el efecto de mejora dependiente de anticuerpos durante la infección por el virus del dengue.

Abstract

La eliminación de anticuerpos nocivos de los organismos es un enfoque valioso para la intervención de enfermedades asociadas a anticuerpos, como la fiebre hemorrágica del dengue y las enfermedades autoinmunes. Dado que miles de anticuerpos con diferentes epítopos están circulando en la sangre, no se informó ningún método universal, excepto el conjugado dual-funcional de péptido antigénico y miméticos Fc-III (DCAF), dirigidos a anticuerpos dañinos específicos. El desarrollo de moléculas DCAF hace una contribución significativa al progreso de la terapia dirigida, que se demostró para eliminar el efecto de mejora dependiente de anticuerpos (ADE) en un modelo de infección por el virus del dengue (DENV) y para aumentar la acetilcolina actividad del receptor en un modelo de miastenia grave. Aquí, describimos un protocolo para la síntesis de una molécula DCAF (DCAF1), que puede bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para atenuar el efecto ADE durante la infección por el virus del dengue, e ilustrar la unión del anticuerpo DCAF1 a 4G2 mediante un ensayo ELISA. En nuestro método, DCAF1 se sintetiza por la conjugación de un derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III y un recombinante expresado largo-hélice con secuencia antigénica a través de la ligación química nativa (NCL). Este protocolo se ha aplicado con éxito a DCAF1, así como a otras moléculas DCAF para apuntar a sus anticuerpos cognados.

Introduction

Los anticuerpos desempeñan un papel importante en la respuesta inmune humoral para la neutralización de bacterias y virus patógenos1. Sin embargo, algunos anticuerpos presentan impactos nocivos para los organismos, como los anticuerpos reactivos cruzados en el efecto ADE durante la infección por DENV y los anticuerpos sobrerreactivos en la miastenia grave, que es una enfermedad autoinmune2,3. El efecto ADE está mediado por los anticuerpos reactivos cruzados que hacen que el puente para conectar las células de presentación del receptor DENV y Fc4,5, mientras que la miastenia grave es causada por los anticuerpos excesivos que atacan los receptores de acetilcolina entre las uniones celulares en el tejido muscular6,7. Aunque se han desarrollado enfoques parcialmente eficaces para tratar estas enfermedades8,9, sin duda, la eliminación directa de estos anticuerpos nocivos haría progresos para las intervenciones.

Recientemente, las moléculas DCAF, que tienen grupos dual-funcionales, se han desarrollado para el bloqueo de anticuerposdirigidos 10. DCAF es un péptido largo que se compone de 3 partes: 1) una parte de antígeno que puede reconocer específicamente el anticuerpo cognado, 2) una etiqueta Fc-III o Fc-III-4C para unirse fuertemente a la región Fc del anticuerpo para inhibir el receptor Fc o complementar las proteínas componentes , 3) un vinculador largo-helical que conjuga estos dos grupos funcionales10. La parte del vinculador, diseñada a partir del dominio Moesin FERM, fue optimizada por el software Rosseta para asegurar que la parte del antígeno y la parte Fc-III en una molécula DCAF puedan unirse a las regiones Fab y Fc de IgG simultáneamente. Cuatro moléculas DCAF se han sintetizado para apuntar a 4 anticuerpos diferentes, entre ellos DCAF1 se utilizó para eliminar el anticuerpo 4G2, que es un anticuerpo reactivo cruzado durante la infección DENV para contribuir al efecto ADE; y DACF4 fue diseñado para el rescate de receptores de acetilcolina mediante el bloqueo de anticuerpos mab35 en miastenia grave10.

En el presente estudio, tomado DCAF1 como ejemplo, mostramos los protocolos para la síntesis de molécula DCAF y la detección de la interacción entre un DCAF y su anticuerpo cognado. El DCAF1 está semisintetizado por NCL approach11,12,13,14, que conjuga el derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III y las partes expresadas del antígeno vinculador. El enfoque NCL tiene ventajas significativas sobre la síntesis totalmente química y la expresión totalmente recombinante para la síntesis DCAF1, porque ambos métodos conducen a un bajo rendimiento y un alto costo. El enfoque actual no sólo es la forma más rentable de obtener el DCAF de longitud completa, sino que también puede mantener la conformación de la parte del vinculador similar a su forma nativa. Dado que las diferentes moléculas dCAF tienen secuencias similares a excepción de las partes del antígeno, nuestros métodos para la síntesis dCAF1 y el ensayo de interacción entre el anticuerpo DCAF1 y 4G2 se pueden aplicar a otras moléculas DCAF a bloques dirigidos también sus anticuerpos cognados.

Protocol

1. Síntesis química del derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III Conversión de resina 2-Cl-(Trt)-Cl a 2-Cl-(Trt)-NHNH2 resina Pesar 625 mg de resina 2-Cl-(Trt)-Cl (0,25 mmol) en un recipiente de síntesis de péptidos de 25 ml. Añadir 5 ml de N,N-dimetilformamida (DMF) a la resina de la parte superior del recipiente, volver a colocar la tapa, agitar suavemente el recipiente durante 15 s y luego drenarlo. Repita el lavado DMF dos veces más. A…

Representative Results

El diagrama de flujo para la ruta de síntesis por ligadura química nativa en este artículo se muestra en la Figura 1. Las figuras 2-6 muestran los cromatogramas (A) y los espectros de masa(B) de derivados químicos de hidrazina sintetizados de un péptido Fc-III, el vinculador y la parte de antígeno expresados recombinantes, el producto purificado de la reacción NCL, el producto de la reacción de desulfuración y el producto final puri…

Discussion

El protocolo aquí describe la semisíntesis y la detección de DCAF1 mediante el enfoque NCL, que se muestra en la Figura 1. En resumen, los dos fragmentos de DCAF1 son sintetizados químicamente y expresados de forma recombinante, respectivamente; entonces, la molécula DCAF1 de longitud completa se ensambla, modifica y purifica. Para la síntesis de fragmentos de Fc-III derivada de la hidrazina, el uso de resina de baja capacidad 2-Cl es bastante importante, porque la alta capacidad tiene…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Tsinghua University-Gates (no. OPP1021992), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n. 21502103, 21877068 y 041301475), y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (n. 2017YFA0505103).

Materials

2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

References

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Cite This Article
Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

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