Summary

Blocage ciblé d'anticorps par un conjugaison bifonctionnel de peptide antigénique et de mimétrie fc-III (DCAF)

Published: September 17, 2019
doi:

Summary

Le développement d’une conjugaison bifonctionnelle de peptide antigénique et de mimétique Fc-III (DCAF) est nouveau pour l’élimination des anticorps nocifs. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la synthèse de la molécule DCAF1, qui peut bloquer sélectivement l’anticorps 4G2 pour éliminer l’effet d’amélioration dépendant des anticorps pendant l’infection de virus de dengue.

Abstract

L’élimination des anticorps nocifs des organismes est une approche précieuse pour l’intervention de maladies associées aux anticorps, telles que la dengue hémorragique et les maladies auto-immunes. Puisque des milliers d’anticorps avec différentes épitopes circulent dans le sang, aucune méthode universelle, excepté la conjugaison dual-fonctionnelle du peptide antigénique et de la mimétique de Fc-III (DCAF), n’a été rapportée pour cibler les anticorps nocifs spécifiques. Le développement de molécules DCAF apporte une contribution significative aux progrès de la thérapie ciblée, qui ont été démontrés pour éliminer l’effet d’amélioration dépendante des anticorps (ADE) dans un modèle d’infection par le virus de la dengue (DENV) et pour stimuler l’acétylcholine l’activité des récepteurs dans un modèle de myasthénie gravis. Ici, nous décrivons un protocole pour la synthèse d’une molécule de DCAF (DCAF1), qui peut bloquer sélectivement l’anticorps 4G2 pour atténuer l’effet d’ADE pendant l’infection de virus de dengue, et illustrer la liaison de l’anticorps de DCAF1 à 4G2 par un test d’ELISA. Dans notre méthode, DCAF1 est synthétisé par la conjugaison d’un dérivé d’hydrazine d’un peptide fc-III et d’un recombinant exprimé longtemps -helix avec séquence antigénique par la ligature chimique indigène (NCL). Ce protocole a été appliqué avec succès à DCAF1 ainsi qu’à d’autres molécules d’ADFA pour cibler leurs anticorps cognate.

Introduction

Les anticorps jouent un rôle important dans la réponse immunitaire humoristique pour la neutralisation des bactéries pathogènes et des virus1. Cependant, certains anticorps présentent des effets nocifs sur les organismes, tels que les anticorps réactifs croisés dans l’effet ADE pendant l’infection à DENV et les anticorps surréactifs dans les gravis de myasthénie, qui est une maladie auto-immune2,3. L’effet ADE est médié par les anticorps réactifs qui font le pont pour relier les cellules de présentation de DENV et de récepteur fc4,5, tandis que la myasthénie gravis est causée par les anticorps excessifs qui attaquent les récepteurs de l’acétylcholine entre les jonctions cellule-cellule dans le tissu musculaire6,7. Bien que des approches partiellement efficaces aient été développées pour traiter ces maladies8,9, sans aucun doute l’élimination directe de ces anticorps nocifs ferait des progrès pour les interventions.

Récemment, des molécules de DCAF, qui ont des groupes dual-fonctionnels, ont été développées pour le blocage ciblé d’anticorps10. DCAF est un long peptide qui est composé de 3 parties: 1) une partie d’antigène qui peut reconnaître spécifiquement l’anticorps cognate, 2) une étiquette Fc-III ou Fc-III-4C pour fortement lier à la région Fc de l’anticorps pour inhiber soit les récepteurs Fc ou compléter les protéines composant , 3) un long lien hélicoïdal qui conjugue ces deux groupes fonctionnels10. La partie de liaison, conçue à partir du domaine Moesin FERM, a été optimisée par le logiciel Rosseta pour s’assurer que la partie antigène et la partie Fc-III d’une molécule DCAF peuvent se lier simultanément aux régions Fab et Fc d’IgG. Quatre molécules de DCAF ont été synthétisées pour cibler 4 anticorps différents, dont DCAF1 a été utilisé pour éliminer l’anticorps 4G2, qui est un anticorps réactif croisé pendant l’infection de DENV pour contribuer à l’effet ADE ; et DACF4 a été conçu pour le sauvetage des récepteurs de l’acétylcholine en bloquant l’anticorps mab35 dans myasthenia gravis10.

Dans la présente étude, prise DCAF1 comme exemple, nous avons montré les protocoles pour la synthèse de la molécule DCAF et la détection de l’interaction entre un DCAF et son anticorps cognate. Le DCAF1 est semi-synthétisé par nCL approche11,12,13,14, qui conjugue le dérivé de l’hydrazine d’un peptide Fc-III et les parties exprimées linker-antigène ensemble. L’approche NCL présente des avantages significatifs par rapport à la synthèse entièrement chimique et à l’expression entièrement recombinante pour la synthèse DCAF1, car ces deux méthodes entraînent un faible rendement et un coût élevé. L’approche actuelle est non seulement le moyen le plus rentable d’obtenir le DCAF pleine longueur, mais peut également maintenir la conformation de la partie de liaison semblable à sa forme indigène. Puisque différentes molécules de DCAF ont des séquences semblables excepté les parties d’antigène, nos méthodes pour la synthèse de DCAF1 et l’analyse d’interaction entre l’anticorps de DCAF1 et 4G2 peuvent être appliquées à d’autres molécules de DCAF pour bloquer de cible leurs anticorps de cognate aussi bien.

Protocol

1. Synthèse chimique du dérivé de l’hydrazine d’un peptide Fc-III Conversion 2-Cl-(Trt)-Cl résine à 2-Cl-(Trt)-NHNH2 résine Peser 625 mg de résine de 2-Cl-(Trt)-Cl (0,25 mmol) dans un récipient de synthèse peptide de 25 ml. Ajouter 5 mL de N,N-dimethylformamide (DMF) à la résine du haut du navire, remettre le bouchon, secouer doucement le navire pendant 15 s, puis le vider. Répétez le lavage DMF pour deux fois de plus. Ajouter 5 ml de dich…

Representative Results

Le diagramme de flux pour la voie de synthèse par ligature chimique indigène dans cet article est montré dans la figure 1. Les figures 2-6 montrent les chromatogrammes (A) et les spectres de masse (B) de dérivés chimiques d’hydrazine synthétisée d’un peptide Fc-III, lien recombinant exprimé et partie antigène, le produit purifié de la réaction NCL, le purifié produit de la réaction de désulfuration et du produit final purifié …

Discussion

Le protocole décrit ici la semi-synthèse et la détection de DCAF1 en utilisant l’approche NCL, qui est montrée dans la figure 1. En bref, les deux fragments de DCAF1 sont synthétisés chimiquement et recombinantement exprimés, respectivement ; ensuite, la molécule DCAF1 pleine longueur est assemblée, modifiée et purifiée. Pour la synthèse de fragments de Fc-III dérivée de l’hydrazine, l’utilisation de résine 2-Cl de faible capacité est très importante, car la capacité élev?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation Tsinghua University-Gates (non. OPP1021992), la National Natural Science Foundation of China (no. 21502103, 21877068 et 041301475), et le National Key Research and Development Program of China (no. 2017YFA0505103).

Materials

2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

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Cite This Article
Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

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