Summary

נוגדנים ממוקד חסימה על ידי המשלים כפול תפקודית של פפטיד Antigenic ו-השלישי מימטיקה (בית קפה)

Published: September 17, 2019
doi:

Summary

פיתוח של המשלים כפול תפקודית של פפטיד אנטיגניים ו-Fc-III mimetics (DCAF) הוא הרומן לחיסול של נוגדנים מזיקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לסינתזה של מולקולה DCAF1, אשר יכול באופן סלקטיבי לחסום נוגדן 4G2 כדי לחסל את ההשפעה התלויה נוגדן שיפור במהלך זיהום וירוס דנגה.

Abstract

חיסול של נוגדנים מזיקים מאורגניזמים הוא גישה רבת ערך להתערבות של מחלות הקשורות נוגדן, כגון קדחת דנגה מדמם ומחלות אוטואימוניות. מאחר שאלפי נוגדנים בעלי אפיסקופים שונים מסתובבים בדם, אין שיטה אוניברסלית, למעט המשלים הדו-תפקודי של הפפטיד האנטי-גניים ו-Fc-III (DCAF), דווחה כדי למקד את הנוגדנים המזיקים הספציפיים. הפיתוח של מולקולות DCAF הופכת תרומה משמעותית להתקדמות של טיפול ממוקד, אשר הוכחו לחסל את ההשפעה שיפור הנוגדן (ADE) אפקט של נגיף דנגה (DENV) זיהום המודל כדי להגביר את אצטילכולין הקולטן פעילות במודל מיאסטניה גרביס. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של מולקולה DCAF (DCAF1), אשר ניתן באופן סלקטיבי לחסום נוגדן 4G2 כדי להחליש את אפקט ADE במהלך זיהום וירוס דנגה, ולהמחיש את הכריכה של DCAF1 כדי 4G2 נוגדן על ידי שיטת אליסה. בשיטה שלנו, DCAF1 הוא מסונתז על ידי הקוניוגציה של נגזרת של הידראזין של פפטיד Fc-III ו רקומביננטי הביע לאורך α-סליל עם רצף אנטיגניים באמצעות הקשר הכימי המקורי (NCL). פרוטוקול זה הוחל בהצלחה על DCAF1, כמו גם מולקולות אחרות של dcaf לצורך התמקדות נוגדנים קנצוני שלהם.

Introduction

נוגדנים לשחק תפקידים חשובים בתגובה החיסונית ומוראלית עבור נטרול של חיידקים פתוגניים ווירוסים1. עם זאת, נוגדנים מסוימים מפגין השפעות מזיקות לאורגניזמים, כגון נוגדנים מתגובתית באפקט ADE במהלך זיהום denv ונוגדנים מגיבים יותר במיאסטניה גראביס, שהיא מחלות אוטואימוניות2,3. האפקט ADE מתווכת על ידי הנוגדנים החוצה תגובתי שעושים את הגשר להתחבר denv ו הקולטן Fc הצגת תאים4,5, בעוד מיאסטניה גרביס נגרמת על ידי נוגדנים מוגזמת התוקפים קולטני אצטילכולין בין הצמתים של תאי התא. ברקמת שריר6,7 למרות שגישות אפקטיביות חלקית פותחו כדי לטפל במחלות אלה8,9, ללא ספק חיסול ישיר של נוגדנים מזיקים אלה יהיה להתקדם התערבויות.

לאחרונה, מולקולות DCAF אשר בעלי פונקציונליות כפולה, פותחו עבור נוגדנים ממוקד חסימת10. Dcaf הוא פפטיד ארוך המורכב מ 3 חלקים: 1) חלק אנטיגן שיכול ספציפי לזהות את הנוגדן קנצוני, 2) fc-iii או השלישי-4c תג עבור מחייב מאוד את האזור fc של נוגדן לעכב או קולטן fc או המשלים חלבונים רכיב , 3) מקשר ארוך α-helical המעלה את שתי הקבוצות האלה פונקציונלי10. החלק המקשר, שתוכנן מתחום מוסין FERM, היה ממוטב על ידי תוכנת Rosseta כדי להבטיח את החלק אנטיגן ו-Fc-III חלק במולקולה DCAF יכול לאגד את האזורים Fab ו Fc של IgG בו. ארבעה מולקולות DCAF יש כבר מסונתז ליעד 4 נוגדנים שונים, ביניהם DCAF1 השתמשו כדי לחסל את הנוגדן 4G2, אשר הוא נוגדן חוצה תגובתי במהלך זיהום DENV לתרום לאפקט ADE; ו DACF4 נועד להצלת קולטני אצטילכולין ידי חסימת mab35 נוגדן במיאסטניה גרביס10.

במחקר הנוכחי, נלקח DCAF1 כדוגמה, הצגנו את הפרוטוקולים לסינתזה של מולקולה dcaf ואת הזיהוי של האינטראקציה בין dcaf ו נוגדן קנצוני שלה. הDCAF1 הוא מסונתז למחצה על ידי הגישה משנת11,12,13,14, אשר מעלה באוב את נגזרות הידראזין של פפטיד Fc-III ואת החלקים מתבטא-אנטיגן ביחד. הגישה NCL יש יתרונות משמעותיים על גבי סינתזה כימית מלאה ביטוי מלא רקומביננטי עבור סינתזה DCAF1, כי שתי שיטות אלה להוביל תשואה נמוכה ועלות גבוהה. הגישה הנוכחית היא לא רק הדרך החסכונית ביותר כדי לקבל את DCAF באורך מלא, אבל גם יכול לשמור על היווצרות של חלק המקשר דומה לצורתו הטבעית. מאז שונים מולקולות dcaf יש רצפים דומים למעט החלקים אנטיגן, השיטות שלנו לסינתזה DCAF1 ואת הקושי האינטראקציה בין DCAF1 ו 4g2 נוגדן ניתן להחיל מולקולות אחרות dcaf כדי ממוקדות לחסום נוגדנים קנצוני שלהם גם.

Protocol

1. הסינתזה הכימית של ה הידראזין של פפטיד Fc-III המרת 2-Cl-(Trt)-Cl שרף ל 2-Cl-(Trt)-NHNH2 שרף שוקלים 625 מ”ג של 2-Cl-(Trt)-קלרנית שרף (0.25 ממול) לתוך כלי סינתזה של 25 מ”ל. הוסף 5 מ ל של N, N-diמתיל (DMF) אל שרף מראש הספינה, לשים את הכובע בחזרה, לנער בעדינות את הכלי עבור 15 s ולאחר מכן לנקז אותו. חזו?…

Representative Results

תרשים הזרימה של תוואי הסינתזה על-ידי הארכה כימית מקורית במאמר זה מוצג באיור 1. דמויות 2-6 מציגות את כרומטוגרמות (A) וספקטרום מסה (ב) של נגזרות כימיות מסונתז הידראזין של פפטיד Fc-III, רקומביננטי הביע מקשר וחלק אנטיגן, המוצר הטהור מתגובת ncl, הטוהר מוצר מתג…

Discussion

הפרוטוקול מתאר להלן את הסינתזה והזיהוי של DCAF1 באמצעות גישת NCL, המוצגת באיור 1. בקצרה, שני שברי DCAF1 הם מסונתז כימי recombinantly ביטא, בהתאמה; לאחר מכן, אורך מלא DCAF1 מולקולה מורכב, שונה ומטוהר. לצורך הידראזין הנגזר הסינתזה של החלקיק השלישי, שימוש ב-2-Cl בעל קיבולת נמוכה, הוא די חשוב, מכיוו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי קרן שערי אוניברסיטת Tsinghua (לא. OPP1021992), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (no. 21502103, 21877068 ו 041301475), ואת תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (no 2017YFA0505103).

Materials

2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

View Video