ここでは、海洋軟体動物アプリシアカリフォルニカの摂食装置に固有の筋肉の最小限に侵襲的な外科的病変のためのプロトコルを提示し、摂食行動中にこれらの筋肉の役割を理解する。
アプリシアカリフォルニカは、学習と行動の神経制御を研究するためのモデルシステムです。この動物は半開き循環システムを有し、重大な損傷を引き起こすことなく、その内部構造の多くにアクセスすることを可能にする。多くの操作は、インビボとインビトロの両方で簡単に行うことができ、動作と神経回路の解析のための非常に扱いやすいモデルです。給餌バッパー内の筋肉の機能をよりよく理解するために、動物の本体腔を開いたり、摂食器官の外層(口腔塊)を損傷することなく、それらを病変する技術を開発しました。この技術では、バッパーは部分的に常に常に、筋肉への直接アクセスを可能にする。この手順は、動物が迅速かつ確実に回復することができます。これにより、I7筋および亜放射状繊維の病変が可能となり、両方の筋肉が生体内の開口部に有意に寄与することを示すことにした。
Aplysia californicaの給餌システムは、学習と記憶を理解するためのモデルシステムとしての長い歴史を持ち、動機付け行動2、3、および行動、バイオメカニクスと給餌中の神経制御4.それは非常にアクセス可能な神経回路を有し、比較的少数の大きく、識別可能なニューロンを持つ。動物は半開き循環システムを有し、重大な損傷を引き起こすことなく、その内部構造の多くにアクセスすることを可能にする。また、インビボとインビトロの両方で多くの操作に強く、挙動と神経回路の解析のための非常に扱いやすいモデルです。
摂食行動を引き起こす神経パターンを理解するためには、摂食器官を構成する柔らかい構造の根底にある力学、口腔質量4を記述することが重要である。バッカル質量5、6を構成する外側の筋肉を特徴付ける作業が行われているが、バッパーの表面を制御する球体塊内の基礎構造の内側の筋肉は、オドントフォア、となってきた。生体内実験では、ほとんどアクセスできません。これらの筋肉の一部の機能に関するインビトロ研究が行われているが、これらの筋肉への直接アクセスの欠如は、動物を振る舞う、無傷で自分の役割を研究することが困難になっています。
Aplysiaまたは同様の軟体動物種における電極移植または病変のためのほとんどの技術は、体壁を開く必要があります 9,10,11,12.体壁を開くと上皮損傷を引き起こし、出血を防ぐために切開部をしっかりと密封する必要があります。さらに深刻な困難は、Aplysiaのバッパーの内側の筋肉(放射状表面の下の筋肉またはオドントフォア内の筋肉)に到達しようとすると、本体の空洞を通って入った後、いくつかのことを通過する必要があります。内部構造へのアクセスを得るために球体塊の筋肉壁の部分(図1A)。この蓄積された傷害とアクセスの困難は、動物がこれらの手術からよく回復しないため、従来の手段を通じてアプローチを問題にしました(完全な逆転を持つ動物の、わずか17%は任意の摂食能力を取り戻しました、N = 12。非エバーテッド動物の約85%が、N=84)を養う能力を取り戻した。
ラッドオープナー8として特徴付けられたI7筋肉は、オドントフォア自体の奥深くにあり、アクセスをさらに複雑にする。これは、ラッド状茎の基部(図1C)と放射状表面の下側の間に伸び、オドントフォアの内膜を通して(図1C)。I7筋肉の3つの側面には筋肉の壁があり、4番目の壁は角状の茎で構成されています。生体力学的研究の目的のために、これらの構造のいずれかに大きな障害は、供給装置の正常な機能を損なうだろう。我々は、顎を通してオドントフォアを働かせて手術を行い、薄くて軟骨な基性表面への切開を通して手術を行い、I7筋の病変を可能にした、ラドラーサーフェスのすぐ下で実行し、ラジキュラー以下の繊維と呼びます(図1C)。
図1:解剖学的概要。(A)アプリシア内の球菌塊の位置。(B) オドントフォアの外部解剖学。ラデュラとラドゥル嚢の表面は黄色です。オドントフォアを構成する筋肉は、実際の色に基づいて赤で表示されます。(C)オドントフォアの矢状部は、基線状繊維(曲面ピンク線)およびI7筋(直線ピンク線)の位置を示す。I6筋の断面は濃い赤色で示されている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
プロトコル内の最も重要なステップは、動物が完全に麻酔されていることを確認する必要性であり、頭の中の筋肉の回りは、基礎となる筋肉にアクセスするのに十分です。これらのステップを完成させるには何らかの練習が必要かもしれませんが、いったん習得すると、手術による収量は、行われたすべての実験の85%を超える可能性があります。プロトコルを適切に変更し、トラブルシューティングする最も重要な方法は、内部筋肉の位置が研究者に完全に明確にできるように、口腔質量の解剖に時間を費やすることです。ラジカル表面を通る推奨切開は必然的に基になる亜放射性繊維に何らかの損傷を引き起こすので、これらの繊維の特定の領域を避けるために切開の正確な位置を変更することが適切な場合があります。
外科的手法の1つの制限は、それが、引き起しの強さなどの摂食応答に非特異的な影響を有し得るであろうことである。この制限を克服する一つの方法は、動物が独自のコントロールとして機能することです。さらに、特定の筋肉(すなわち、I7またはSRF)の除去を除いて、外科プロトコル全体に供される偽の病変群を有することが重要である。これらの提案に従うことによって、研究者は動物間の変動の影響を減らし、外科手術の非特異的効果の本質的な尺度を持つ。
以前の研究は、病変または神経13、14、または筋肉15、16、17のいずれかから記録するために体壁を介してアプローチを使用しています。私たちの研究室では、体壁切開はしばしばヘモリンパの著しい損失を伴い、したがって体積を伴うことを逸話的に観察しました。動物は、多くの場合、これから回復するために数日を必要とし、体壁病変が慎重に縫合されていない場合、動物は回復しないことがあります。さらに、動物の死後検査は、切開の周りにかなりの瘢痕と強い免疫応答(逸話的観察)を明らかにする。対照的に、動物は、ここで説明したプロトコルからの回復後のhemoinmphの損失または体積の変化を示さない(96匹の動物の観察に基づく)。
技術の将来の応用は、Aplysiaの摂食装置内の他の筋肉、および他の動物に拡張し得る。我々は、I7筋肉および亜放射状繊維の除去に焦点を当てている。これらの同じ一般的な外科的技術はまた、オドントフォアの他の筋肉のほとんどへのアクセスを可能にする。これらのいくつかは、I5筋の内部部分など、放射状の表面を通してアクセスされるのが最適です。他の人は、I4の内側のリーフレットのように、オドントフォアの外皮を通してより良い到達することができるかもしれません。我々は、部分的に絶え間ないオドントフォアの基性裂断下の切開が、その後、オドントフォア内の別の筋肉を病変するために使用することができる鋭利なフックへのアクセスを可能にした予備試験を行った、 筋肉I88。ここで説明する外科的プロトコルは本体空洞を開かないため、縫合は必要ない。
我々が説明したプロトコルは、他の軟体動物の摂食装置など、操作が困難な軟部組織構造に取り組む他の研究者に一般的に関心があるかもしれない。より一般的には、このプロトコルは、舌、幹または触手18のような柔らかい構造の分析に対する他の新しい外科的アプローチを示唆し得る。
The authors have nothing to disclose.
シェリー・ニゲル、シジ・ルー、ジョーイ・ウーがこれらのプロトコルの改善と検証に取り組んだ努力を認めたいと思います。この作業は、NSF グラント IOS 1754869 によってサポートされました。
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Webcam | Logitech | c920 | for recording data |