Hier presenteren we een protocol voor minimaal invasieve chirurgische lesioning van spieren intrinsiek aan het Voer apparaat van de mariene weekdieren Aplysia californica om de rollen van deze spieren te begrijpen tijdens het voeden gedrag.
Aplysia californica is een modelsysteem voor het bestuderen van de neurale beheersing van leren en gedrag. Dit dier heeft een semi-open bloedsomloop, waardoor het mogelijk is om toegang te krijgen tot veel van zijn interne structuren zonder aanzienlijke schade te veroorzaken. Veel manipulaties kunnen zowel in vivo als in vitro gemakkelijk worden uitgevoerd, waardoor het een zeer Tractable model is voor de analyse van gedrag en neurale circuits. Om beter inzicht te krijgen in de functies van de spieren binnen de voedende grasper, hebben we een techniek ontwikkeld om ze te lesioneren zonder de hoofd lichaamsholte van het dier te openen of de buitenste lagen van het voedings orgaan te beschadigen (d.w.z. de buccale massa). In deze techniek wordt de grasper gedeeltelijk binnengejaagd, waardoor directe toegang tot de spier massa mogelijk is. Met deze procedure kunnen dieren snel en betrouwbaar herstellen. Dit heeft het mogelijk gemaakt om de i7-spieren en sub-radulaire vezels te laesie, waardoor we kunnen aantonen dat beide spieren aanzienlijk bijdragen aan de opening in vivo.
Het voersysteem van aplysia californica heeft een lange geschiedenis van gebruik als een modelsysteem voor het begrijpen van leren en geheugen1, gemotiveerd gedrag2,3, en de interactie tussen gedrag, biomechanica en neurale controle tijdens het voeden4. Het heeft zeer toegankelijke neurale circuits, met een relatief klein aantal grote, identificeerbare neuronen. Het dier heeft een semi-open bloedsomloop, waardoor het mogelijk is om toegang te krijgen tot veel van zijn interne structuren zonder aanzienlijke schade te veroorzaken. Het is ook robuust voor vele manipulaties zowel in vivo en in vitro, waardoor het een zeer Tractable model voor de analyse van gedrag en neurale circuits.
Om de neurale patronen te begrijpen die aanleiding geven tot voedingsgedrag, is het belangrijk om de onderliggende mechanica van de zachte structuur te beschrijven die het voedings orgaan vormt, de buccale Mass4. Hoewel er werk is gedaan om de buitenste spieren te karakteriseren die de buccale massa5,6vormen, zijn de binnenste spieren van de onderliggende structuur binnen de buccale massa die het oppervlak van de grasper, de odontophore, regelt, grotendeels ontoegankelijk voor in vivo experimenten. Hoewel er in vitro studies zijn geweest over de functies van sommige van deze spieren7,8, het gebrek aan directe toegang tot deze spieren heeft het moeilijk gemaakt om hun rol in intact te bestuderen, dieren te gedragen.
De meeste technieken voor het implanteren van elektroden of laesies in aplysie of soortgelijke slakken scan vereisen dat de lichaams wand wordt geopend9,10,11,12. Het openen van de lichaams wand veroorzaakt epitheel letsel, en de incisie moet veilig worden verzegeld om te voorkomen dat Hemolymfe ontsnappen. Er worden nog ernstigere moeilijkheden gesteld bij het bereiken van de binnenste spieren van de grasper van Aplysie (spieren die aan het radulaire oppervlak of binnen de odontophore liggen): na het betreden van de hoofd lichaamsholte moet men dan door een aantal gedeelte van de spier wand van de buccale massa om toegang te krijgen tot de inwendige structuren (Figuur 1a). Dit geaccumuleerde letsel en moeilijkheden van de toegang heeft de aanpak via conventionele middelen problematisch gemaakt, omdat dieren niet goed herstellen van deze operaties (van dieren met volledige eversies, slechts 17% herwonnen elke voeding vermogen, N = 12. Rond 85% van de niet-everted dieren herwonnen de mogelijkheid om te voeden, N = 84).
De i7-spier, die is gekarakteriseerd als een radulaire opener8, is diep in de odontophore zelf, verdere complicerende toegang. Het strekt zich uit tussen de basis van de radulaire stalken (figuur 1c) en de onderzijde van het radulaire oppervlak, door een lumen in de odontophore (figuur 1c). Aan drie zijden van de i7 spieren zijn muren van de spier, en de vierde wand bestaat uit de radulaire Stalk. Voor de toepassing van een biomechanische studie zou een ernstige aantasting van een van deze structuren de normale werking van het voeder apparaat in gevaar brengen. We ontwikkelden een nieuwe aanpak van het werken van de odontophore uit door de kaken, en het uitvoeren van de operatie door middel van een incisie naar het dunne, kraakbeenachtige radulaire oppervlak, dat het mogelijk maakte om de i7 spier te laesie, evenals onlangs beschreven fijne spiervezels die ren net onder het radulaire oppervlak, waarnaar we verwijzen als de sub-radulaire vezels (figuur 1c).
Figuur 1: anatomische overzicht. A) plaats van de buccale massa in aplysie. B) uitwendige anatomie van odontophore. Het oppervlak van radula en radular SAC zijn geel; spieren die de odontophore samenstellen, worden in rood weergegeven op basis van hun werkelijke kleuren. C) Sagittaal gedeelte van odontophore, met de locatie van sub-radulaire vezels (gebogen roze lijn) en i7-spier (rechte roze lijn). Dwarsdoorsnede van de i6 spier wordt weergegeven in donkerrood. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De meest kritische stappen binnen het protocol zijn de noodzaak om ervoor te zorgen dat het dier volledig verdoiliseerd is, en dat de eversie van de buccale massa net genoeg is om toegang te krijgen tot de onderliggende spieren. Het kan enige oefening nodig om deze stappen te perfectioneren, maar zodra ze worden beheerst, de opbrengst van operaties is waarschijnlijk groter dan 85% van alle experimenten gedaan. De belangrijkste manier om het protocol correct te wijzigen en op te lossen is om tijd te besteden aan het doen van dissecties van de buccale massa, zodat de locaties van de inwendige spieren volledig duidelijk zijn voor de onderzoeker. Omdat de voorgestelde incisie door het radulaire oppervlak onvermijdelijk enige schade aan de onderliggende sub-radulaire vezels veroorzaakt, kan het gepast zijn om de exacte locatie van de incisie te wijzigen om specifieke gebieden van deze vezels te vermijden.
Een beperking van de chirurgische techniek is dat het niet-specifieke effecten kan hebben op het voeren van reacties, zoals de sterkte van het trekken. Een manier om deze beperking te overwinnen is om dieren te laten dienen als hun eigen controles. Bovendien is het van cruciaal belang om een Sham-laesie groep te hebben die wordt onderworpen aan het gehele chirurgische protocol, behalve voor het verwijderen van de specifieke spier (d.w.z. i7 of de Srf’s). Door deze suggesties te volgen, zal een onderzoeker de effecten van variabiliteit tussen dieren verminderen en een intrinsieke maatstaf van de niet-specifieke effecten van chirurgie hebben.
Eerder werk heeft benaderingen gebruikt door de lichaams wand om te laesie of opnemen van zenuwen13,14, of spieren15,16,17. In ons laboratorium, we hebben anekdotische waargenomen dat lichaams muur incisies vaak gepaard gaan met een significant verlies van Hemolymfe en dus van lichaams volume. Dieren vereisen vaak enkele dagen om te herstellen van deze, en als het lichaam wand laesie niet zorgvuldig wordt gehecht, dieren kunnen niet herstellen. Bovendien onthult een postmortemkeuring van de dieren een aanzienlijke littekenvorming rond de incisie en een sterke immuunrespons (anekdotische waarnemingen). In tegenstelling, dieren vertonen geen verlies van Hemolymfe of verandering in lichaams volume na herstel van het protocol hier beschreven (op basis van waarnemingen in 96 dieren).
Toekomstige toepassingen van de techniek kunnen deze uitbreiden naar andere spieren binnen het voeder apparaat van Aplysia en naar andere dieren. We hebben ons geconcentreerd op het verwijderen van de i7-spieren en sub-radulaire vezels. Deze zelfde algemene chirurgische technieken bieden ook toegang tot de meeste andere spieren van de odontophore. Sommige hiervan, zoals het inwendige gedeelte van de i5-spier, zijn het best toegankelijk via het radulaire oppervlak. Anderen, zoals de binnenste folders van I4, kunnen beter worden bereikt door het uitwendige epitheel van de odontophore. We hebben voorbereidende proeven gemaakt waarbij een incisie onder de radulaire spleet van de gedeeltelijk veroorzaakte odontophore toegang mogelijk maakte tot een geslepen haak die vervolgens kon worden gebruikt om een andere spier binnen de odontophore, de spier i88, te laten vallen. Omdat het chirurgische protocol dat hier wordt beschreven, de hoofd lichaamsholte niet opent, is er geen hechten vereist.
Het protocol dat we hebben beschreven, kan van algemeen belang zijn voor andere onderzoekers die werken aan weke delen structuren die anders moeilijk te manipuleren zouden zijn, bijvoorbeeld het Voer apparaat van andere weekdieren. Meer in het algemeen zou dit protocol andere nieuwe chirurgische benaderingen voor de analyse van zachte structuren zoals tongen, Trunks of tentakels18kunnen suggereren.
The authors have nothing to disclose.
We willen het harde werk erkennen dat Sherry Niggel, SiSi Lu en Joey Wu hebben gestoken in het verbeteren en valideren van deze protocollen. Dit werk werd ondersteund door NSF Grant IOS 1754869.
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Webcam | Logitech | c920 | for recording data |