Qui presentiamo un protocollo per la parte chirurgica minimamente invasiva dei muscoli intrinseci all’apparato alimentare del mollusco marino Aplysia californica per comprendere i ruoli di questi muscoli durante il comportamento di alimentazione.
Aplysia californica è un sistema modello per studiare il controllo neurale dell’apprendimento e del comportamento. Questo animale ha un sistema circolatorio semi-aperto, che consente di accedere a molte delle sue strutture interne senza causare danni significativi. Molte manipolazioni possono essere facilmente eseguite sia in vivo che in vitro, rendendolo un modello altamente trattabile per l’analisi del comportamento e dei circuiti neurali. Per comprendere meglio le funzioni dei muscoli all’interno dell’alimentazione grasper, abbiamo sviluppato una tecnica per litigersenza di litigare senza aprire la cavità del corpo principale dell’animale o danneggiare gli strati esterni dell’organo di alimentazione (cioè la massa buccale). In questa tecnica, il grasper è parzialmente evitato, consentendo l’accesso diretto alla muscolatura. Questa procedura consente agli animali di recuperare rapidamente e in modo affidabile. Questo ha permesso di lesionare i muscoli I7 e le fibre sub-radulari, permettendoci di dimostrare che entrambi i muscoli contribuiscono in modo significativo all’apertura in vivo.
Il sistema di alimentazione di Aplysia californica ha una lungastoria di utilizzo come sistema modello per comprendere l’apprendimento e la memoria 1, comportamenti motivati2,3, e l’interazione tra comportamento, biomeccanica e controllo neurale durante l’alimentazione4. Ha circuiti neurali altamente accessibili, con un numero relativamente piccolo di grandi neuroni identificabili. L’animale ha un sistema circolatorio semi-aperto, che consente di accedere a molte delle sue strutture interne senza causare danni significativi. È anche robusto per molte manipolazioni sia in vivo che in vitro, rendendolo un modello altamente trattabile per l’analisi del comportamento e dei circuiti neurali.
Per comprendere i modelli neurali che danno origine a comportamenti di alimentazione, è importante descrivere la meccanica sottostante della struttura morbida che costituisce l’organo di alimentazione, la massa buccale4. Mentre è stato fatto del lavoro per caratterizzare i muscoli esterni che compongono la massa buccale5,6, i muscoli interni della struttura sottostante all’interno della massa buccale che controlla la superficie del grasper, l’odontofo, sono stati in gran parte inaccessibile alla sperimentazione in vivo. Anche se ci sono stati studi in vitro sulle funzioni di alcuni di questi muscoli7,8, la mancanza di accesso diretto a questi muscoli ha reso difficile studiare il loro ruolo in animali intatti e comportarsi.
La maggior parte delle tecniche per l’impianto di elettrodi o lesioni in Aplysia o specie di molluscan simili richiedono che la parete del corpo sia aperta9,10,11,12. L’apertura della parete del corpo provoca lesioni epiteliali e l’incisione deve essere sigillata in modo sicuro per evitare la fuga da emolinfa. Ancora più gravi difficoltà sono poste quando si tenta di raggiungere i muscoli interni della grasper di Aplysia (muscoli alla base della superficie ralalare o all’interno dell’odontoforo): dopo essere entrati attraverso la cavità del corpo principale, si deve poi passare attraverso alcuni parte della parete muscolare della massa buccale per ottenere l’accesso alle strutture interne (Figura 1A). Questa lesione accumulata e la difficoltà di accesso hanno reso problematico l’approccio attraverso i mezzi convenzionali perché gli animali non si riprendono bene da questi interventi chirurgici (di animali con eversioni complete, solo il 17% ha riacquistato alcuna capacità di alimentazione, N – 12. Circa l’85% degli animali non eversi ha riacquistato la capacità di nutrirsi, N – 84).
Il muscolo I7, che è stato caratterizzato come un’apertura radulare8, è profondo all’interno dell’odontoforo stesso, complicando ulteriormente l’accesso. Si estende tra la base del gambo ralalalare (Figura 1C) e la parte inferiore della superficie radulare, attraverso un lume nell’odontoforo (Figura 1C). Su tre lati dei muscoli I7 sono pareti del muscolo, e la quarta parete è costituita dal gambo ralalare. Ai fini di uno studio biomeccanico, una grave compromissione di una qualsiasi di queste strutture comprometterebbe la normale funzione dell’apparato alimentare. Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di lavorare l’odontoforo attraverso le mascelle, e condurre l’intervento chirurgico attraverso un’incisione alla sottile superficie rapulcolare cartilaginea, che ha reso possibile lesione del muscolo I7, così come le fibre muscolari fini appena descritte che appena sotto la superficie radulare, che si riferisce come le fibre sub-radulari (Figura 1C).
Figura 1: Panoramica anatomica. (A) Posizione della massa buccale all’interno dell’Aplysia. (B) Anatomia esterna dell’odontoforo. La superficie della radula e del sacco ralaare sono gialle; i muscoli che compongono l’odontoforo sono mostrati in rosso, in base ai loro colori reali. (C) Sezione sagittale dell’odontotoiatorio, che mostra la posizione delle fibre sub-radulari (linea rosa curva) e del muscolo I7 (linea rosa dritta). La sezione trasversale del muscolo I6 è mostrata in rosso scuro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I passaggi più critici all’interno del protocollo sono la necessità di garantire che l’animale sia completamente anetizzato e che l’eversione della massa buccale sia sufficiente per accedere ai muscoli sottostanti. Può richiedere una certa pratica per perfezionare questi passaggi, ma una volta che sono padroneggiati, il rendimento da interventi chirurgici è probabile che sia superiore all’85% di tutti gli esperimenti fatti. Il modo più importante per modificare e risolvere correttamente il protocollo è quello di trascorrere del tempo facendo dissezioni della massa buccale in modo che le posizioni dei muscoli interni siano completamente chiare per lo sperimentatore. Poiché l’incisione suggerita attraverso la superficie ralalare provoca inevitabilmente alcuni danni alle fibre sub-ralalari sottostanti, può essere opportuno modificare l’esatta posizione dell’incisione per evitare specifiche regioni di queste fibre.
Una limitazione della tecnica chirurgica è che può avere effetti non specifici sulle risposte di alimentazione, come la forza della protrazione. Un modo per superare questa limitazione è far servire gli animali come propri controlli. Inoltre, è fondamentale avere un gruppo di lesioni fittizie che è sottoposto all’intero protocollo chirurgico ad eccezione della rimozione del muscolo specifico (cioè I7 o SRF). Seguendo questi suggerimenti, uno sperimentatore ridurrà gli effetti della variabilità tra gli animali e avrà una misura intrinseca degli effetti non specifici della chirurgia.
Il lavoro precedente ha utilizzato approcci attraverso la parete del corpo per lesione o registrare da nervi13,14, o muscoli15,16,17. Nel nostro laboratorio, abbiamo osservato aneddoticamente che le incisioni delle pareti del corpo sono spesso accompagnate da una significativa perdita di emolina e quindi del volume corporeo. Gli animali spesso richiedono diversi giorni per recuperare da questo, e se la lesione della parete del corpo non è accuratamente suturata, gli animali non possono recuperare. Inoltre, l’esame post-mortem degli animali rivela notevoli cicatrici intorno all’incisione e una forte risposta immunitaria (osservazioni aneddotiche). Al contrario, gli animali non mostrano alcuna perdita di emolina o variazione del volume corporeo dopo il recupero dal protocollo qui descritto (sulla base di osservazioni in 96 animali).
Le future applicazioni della tecnica possono estenderlo ad altri muscoli all’interno dell’apparato alimentare dell’Aplysia e ad altri animali. Ci siamo concentrati sulla rimozione del muscolo I7 e delle fibre sub-radulari. Queste stesse tecniche chirurgiche generali consentono anche l’accesso alla maggior parte degli altri muscoli dell’odontoforo. Alcuni di questi, come la parte interna del muscolo I5, sono meglio accessibili attraverso la superficie raularele. Altri, come i volantini interni di I4, possono essere meglio raggiunti attraverso l’epitelio esterno dell’odontoforo. Abbiamo fatto prove preliminari in cui un’incisione sotto la fessura radulare dell’odontoforo parzialmente eversato ha permesso l’accesso per un gancio affilato da inserire che potrebbe poi essere utilizzato per lesione di un altro muscolo all’interno dell’odontoforo, muscolo I88. Poiché il protocollo chirurgico qui descritto non apre la cavità del corpo principale, non è necessaria alcuna sutura.
Il protocollo che abbiamo descritto può essere di interesse generale per altri ricercatori che lavorano su strutture di tessuti molli che altrimenti sarebbero difficili da manipolare, ad esempio l’apparato alimentare di altri molluschi. Più in generale, questo protocollo potrebbe suggerire altri nuovi approcci chirurgici all’analisi di strutture morbide come lingue, tronchi o tentacoli18.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo riconoscere il duro lavoro che Sherry Niggel, Sisi Lu e Joey Wu hanno messo nel miglioramento e nella convalida di questi protocolli. Questo lavoro è stato supportato da NSF Grant IOS 1754869.
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Webcam | Logitech | c920 | for recording data |