Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe
Summary
Die Kombination aus Antikörperkennzeichnung, optischer Lichtreinigung und fortschrittlicher Lichtmikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Analyse kompletter Strukturen oder Organe. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, um die Immunkennzeichnung dicker Nierenscheiben, die optische Reinigung mit Ethyl-Cinnamat und die konfokale Bildgebung zu kombinieren, die die Visualisierung und Quantifizierung dreidimensionaler Nierenstrukturen ermöglicht.
Abstract
Optische Clearing-Techniken machen Gewebe transparent, indem der Brechungsindex in einer Probe für die nachfolgende dreidimensionale (3-D) Bildgebung ausgeglichen wird. Sie haben in allen Forschungsbereichen große Aufmerksamkeit auf das Potenzial zur Analyse mikroskopischer mehrzelliger Strukturen erhalten, die sich über makroskopische Entfernungen erstrecken. Angesichts der Tatsache, dass sich Nierentubuli, Vaskulatur, Nerven und Glomeruli in viele Richtungen ausdehnen, die bisher nur teilweise durch traditionelle zweidimensionale Techniken erfasst wurden, eröffnete die Geweberäumung auch viele neue Bereiche der Nierenforschung. Die Liste der optischen Clearing-Methoden wächst schnell, aber es bleibt schwierig für Anfänger in diesem Bereich, die beste Methode für eine bestimmte Forschungsfrage zu wählen. Hier ist eine einfache Methode, die Antikörper-Etikettierung von dicken Maus Nierenscheiben kombiniert; optische Clearing mit billigem, ungiftigem und gebrauchsfertigem chemischen Ethyl-Cinnamat; und konfokale Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Nieren durchsetzt und einen Antigen-Retrieval-Schritt verwendet, um die Antikörperbindung zu erhöhen, ohne spezielle Geräte zu benötigen. Seine Anwendung wird in der Bildgebung verschiedener multizellulärer Strukturen innerhalb der Niere vorgestellt, und wie man schlechte Antikörper-Penetration in Gewebe zu beheben wird behandelt. Wir diskutieren auch die potenziellen Schwierigkeiten der Bildgebung endogene Fluorophore und den Erwerb sehr großer Proben und wie sie überwunden werden können. Dieses einfache Protokoll bietet ein einfach einzurichtendes und umfassendes Werkzeug, um Gewebe in drei Dimensionen zu untersuchen.
Introduction
Das wachsende Interesse an der Untersuchung ganzer Organe oder großer mehrzelliger Strukturen hat zur Entwicklung optischer Clearingmethoden geführt, die die Abbildung von transparentem Gewebe in drei Dimensionen beinhalten. Bis vor kurzem waren die besten Methoden zur Schätzung der Zellzahl, -länge oder des Volumens ganzer Strukturen die Stereologie oder die erschöpfende serielle Schnitte, die auf der systemischen Probenahme von Gewebe für die nachfolgende Analyse in zwei Dimensionen basiert1, 2 , 3. Diese Methoden sind jedoch zeitaufwändig und benötigen ein hohes Maß an Ausbildung und Fachwissen4. Optische Clearing-Methoden überwinden diese Probleme, indem sie den Brechungsindex in einer Probe ausdematrieren, um Gewebe transluzent für die 3D-Bildgebung5,6,7zu machen.
Es wurden mehrere optische Clearing-Methoden entwickelt, die in zwei Hauptkategorien unterteilt sind: lösemittelbasierte und wässrige Methoden. Wässrige Methoden können weiter unterteilt werden in einfaches Eintauchen8,9, Hyperhydration10,11und Hydrogel einbetten12,13. Lösemittelbasierte Methoden dehydrieren das Gewebe, entfernen Lipide und normalisieren den Brechungsindex auf einen Wert um 1,55. Einschränkungen der meisten lösungsmittelbasierten Methoden sind das Abschrecken der endogenen Fluoreszenz von häufig verwendeten Reporterproteinen wie GFP, Lösungsmitteltoxizität, die Fähigkeit, Klebstoffe aufzulösen, die in einigen Bildkammern oder Objektivlinsen verwendet werden, und die Schrumpfung von Gewebe während der Austrocknung14,15,16,17,18,19,20,21. Lösemittelbasierte Methoden sind jedoch einfach, zeitsparend und können in einer Reihe von verschiedenen Gewebetypen funktionieren.
Wässrige Methoden basieren auf dem Eintauchen des Gewebes in wässrige Lösungen, die Brechungsindizes im Bereich von 1,38-1,528,11,12,22,23,24 haben . Diese Methoden wurden entwickelt, um die emission von endogenen fluoreszierenden Reportern zu erhalten und dehydrationsinduzierte Schrumpfung zu verhindern, aber die Einschränkungen der meisten wässrigen Clearingmethoden umfassen eine längere Dauer des Protokolls, Gewebeausdehnung und Proteinmodifikation (d.h. partielle Denaturierung von Proteinen durch Harnstoff in hyperhydrierenden Protokollen wie ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS adressierte Gewebeexpansion durch die Kombination von Harnstoff mit Sorbitol, das durch Dehydrierung die Harnstoff-induzierte Gewebeexpansion ausbalanciert und die Gewebe-Ultrastruktur, wie durch Elektronenmikroskopie ausgewertet10. Die Schrumpfung oder Ausdehnung von Gewebe wirkt sich auf die absoluten Größen von Strukturen, Abstände zwischen Objekten oder die Zelldichte pro Volumen aus. So kann die Messung von Größenänderungen bei der Reinigung des Gewebes helfen, die erhaltenen Ergebnisse7,26zu interpretieren.
Im Allgemeinen besteht ein Protokoll für optisches Clearing aus mehreren Schritten, einschließlich Vorbehandlung, Permeabilisierung, Immunkennzeichnung (falls erforderlich), Brechungsindex-Matching und Bildgebung mit fortgeschrittener Lichtmikroskopie (z. B. Zweiphotonen, konfokale oder Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie). Die meisten Clearing-Ansätze wurden entwickelt, um neuronales Gewebe zu visualisieren, und neue Studien haben ihre Anwendung in anderen Organen validiert5. Dieses umfassende Tool wurde zuvor gezeigt, um eine zuverlässige und effiziente Analyse von Nierenstrukturen zu ermöglichen, einschließlich Glomeruli27,28, Immuninfiltrate28, Vaskulatur28und Tubule Segmente 29, und es ist ein idealer Ansatz, um das Verständnis der glomerulären Funktion und Tubule Umbau in Gesundheit und Krankheit zu verbessern.
Zusammengefasst ist hier eine lösungsmittelbasierte Methode, die Immunfärbung von Nierentubuli kombiniert; optische Clearing mit billigen, ungiftigen und gebrauchsfertigen chemischen Ethyl-Cinnamate (ECi); und konfokale Mikroskopie-Bildgebung, die eine vollständige Tubule-Visualisierung und Quantifizierung ermöglicht. Diese Methode ist einfach, kombiniert Antigen-Retrieval von Nierenscheiben mit Färbung von kommerziellen Antikörpern, und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die es für die meisten Laboratorien zugänglich macht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optische Clearing-Techniken haben große Aufmerksamkeit für die 3-D-Visualisierung und Quantifizierung der Mikroanatomie in verschiedenen Organen erhalten. Hier wurde die lösungsmittelbasierte Clearing-Methode (ECi) mit der Immunolabelierung zur 3-D-Bildgebung ganzer Tubuli in Nierenscheiben kombiniert. Diese Methode ist einfach, kostengünstig und schnell. Andere Forschungsfragen können jedoch am besten mit anderen Clearingprotokollen beantwortet werden5. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S. wird durch Stipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG (332853055), der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) und der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen (RWTH Returner Program) unterstützt. Unterstützt wird V. G. P. durch Forschungsstipendien der Deutschen Gesellschaft fur Nephrologie, der Alexander von Humboldt-Stiftung und des National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E wird von der Fondation LeDucq unterstützt. Gefördert wird R. K. durch Stipendien der DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), des Landes Nordrhein-Westfalen (MIWF-NRW) und des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung der RWTH Aachen (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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