Effacement optique et imagerie du tissu rénal immunolabeled
Summary
La combinaison de l’étiquetage des anticorps, de la compensation optique et de la microscopie lumineuse avancée permet une analyse tridimensionnelle des structures ou organes complets. Décrit ici est une méthode simple pour combiner l’immunolabeling des tranches de rein épaisses, la compensation optique avec le cinnamate d’éthyle, et l’imagerie confocale qui permet la visualisation et la quantification des structures tridimensionnelles de rein.
Abstract
Les techniques de compensation optique rendent le tissu transparent en équilibrant l’indice de réfraction dans l’ensemble d’un échantillon pour la formation image tridimensionnelle (3-D) subséquente. Ils ont reçu une grande attention dans tous les domaines de recherche pour le potentiel d’analyser les structures microscopiques multicellulaires qui s’étendent sur des distances macroscopiques. Étant donné que les tubules de rein, la vascularisation, les nerfs, et le glomeruli s’étendent dans beaucoup de directions, qui ont été seulement partiellement capturées par les techniques bidimensionnelles traditionnelles jusqu’ici, dégagement de tissu a également ouvert de nombreux nouveaux secteurs de la recherche de rein. La liste des méthodes de compensation optique s’allonge rapidement, mais il reste difficile pour les débutants dans ce domaine de choisir la meilleure méthode pour une question de recherche donnée. Fourni ici est une méthode simple qui combine l’étiquetage des anticorps des tranches de rein de souris épaisses; compensation optique avec cinnamate d’éthyle chimique bon marché, non toxique et prêt à l’emploi; et l’imagerie confocale. Ce protocole décrit comment perfuter les reins et utiliser une étape de récupération d’antigène pour augmenter la liaison des anticorps sans avoir besoin d’équipement spécialisé. Son application est présentée dans l’imagerie de différentes structures multicellulaires dans le rein, et comment dépanner la pénétration des anticorps pauvres dans les tissus est abordée. Nous discutons également des difficultés potentielles de l’imagerie fluorophores endogènes et l’acquisition de très grands échantillons et comment les surmonter. Ce protocole simple fournit un outil facile à installer et complet pour étudier les tissus en trois dimensions.
Introduction
L’intérêt croissant pour l’étude d’organes entiers ou de grandes structures multicellulaires a conduit au développement de méthodes de compensation optique qui impliquent l’imagerie de tissus transparents en trois dimensions. Jusqu’à récemment, les meilleures méthodes pour estimer le nombre, la longueur ou le volume des structures entières étaient la stérilisation ou la section sérielle exhaustive, qui est basée sur l’échantillonnage systémique des tissus pour l’analyse ultérieure en deux dimensions1, 2 (en) , 3. Cependant, ces méthodes prennent beaucoup de temps et nécessitent un niveau élevé de formation et d’expertise4. Les méthodes de compensation optique surmontent ces problèmes en équilibrant l’indice de réfraction dans l’ensemble d’un échantillon pour rendre les tissus translucides pour l’imagerie 3D5,6,7.
Plusieurs méthodes de compensation optique ont été développées qui se divisent en deux grandes catégories : les méthodes à base de solvants et les méthodes aqueuses. Les méthodes aqueuses peuvent être encore divisées en immersion simple8,9, hyperhydratation10,11, et hydrogel encastrer12,13. Les méthodes à base de solvant déshydratent le tissu, enlèvent les lipides et normalisent l’indice de réfraction à une valeur d’environ 1,55. Les limites de la plupart des méthodes à base de solvants sont l’étanchéité de la fluorescence endogène des protéines journaliste couramment utilisées telles que le GFP, la toxicité des solvants, la capacité de dissoudre les colles utilisées dans certaines chambres d’imagerie ou lentilles objectives, et le rétrécissement des tissus pendant déshydratation14,15,16,17,18,19,20,21. Cependant, les méthodes basées sur les solvants sont simples, efficaces en temps, et peuvent fonctionner dans un certain nombre de différents types de tissus.
Les méthodes aqueuses s’appuient sur l’immersion du tissu dans des solutions aqueuses qui ont des indices réfractifs de l’ordre de 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Ces méthodes ont été développées pour préserver l’émission endogène de protéines fluorescentes de reporter et pour empêcher le rétrécissement déshydraté-induit, mais les limites de la plupart des méthodes aqueuses-basées de compensation incluent une plus longue durée du protocole, l’expansion de tissu, et modification des protéines (c.-à-d. dénaturation partielle des protéines par urée dans des protocoles hyperhydratants tels que ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS a abordé l’expansion des tissus en combinant l’urée avec le sorbitol, qui contrebalance par déshydratation l’expansion des tissus induites par l’urée, et a préservé l’ultrastructure tissulaire telle qu’évaluée par microscopie électronique10. Le rétrécissement ou l’expansion des tissus affecte la taille absolue des structures, les distances entre les objets ou la densité cellulaire par volume; ainsi, la mesure des changements de taille au nettoyage du tissu peut aider à interpréter les résultats obtenus7,26.
En général, un protocole de compensation optique se compose de plusieurs étapes, y compris le prétraitement, la perméabilisation, l’immunoétiquetage (si nécessaire), l’appariement de l’indice réfractif et l’imagerie avec microscopie lumineuse avancée (p. ex. deux photons, confocal, ou microscopie de fluorescence par feuille de lumière). La plupart des approches de compensation ont été développées pour visualiser le tissu neuronal, et des études émergentes ont validé leur application dans d’autres organes5. Cet outil complet a été précédemment démontré pour permettre l’analyse fiable et efficace des structures rénales, y compris glomeruli27,28, immunisé infiltre28, vascularisation28, et les segments tubule 29, et c’est une approche idéale pour améliorer la compréhension de la fonction glomerulaire et le remodelage de tubule dans la santé et la maladie.
Résumé ici est une méthode à base de solvant qui combine l’immunostaining des tubules rénaux; compensation optique avec cinnamate d’éthyle chimique bon marché, non toxique et prêt à l’emploi (ECi); et l’imagerie par microscopie confocale qui permet une visualisation et une quantification complètes des tubules. Cette méthode est simple, combine la récupération d’antigènes de tranches de rein avec la coloration d’anticorps commerciaux, et ne nécessite pas d’équipement spécialisé, ce qui le rend accessible à la plupart des laboratoires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les techniques de compensation optique ont reçu une grande attention pour la visualisation 3D et la quantification de la microanatomie dans divers organes. Ici, la méthode de compensation solvant-basée (ECi) a été combinée avec l’immunolabeling pour l’imagerie 3-D des tubules entiers dans des tranches de rein. Cette méthode est simple, peu coûteuse et rapide. Cependant, d’autres questions de recherche peuvent être mieux répondues avec d’autres protocoles de compensation5. Il est égaleme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S. est soutenu par des subventions de la DFG German Research Foundation (332853055), else Kr’ner-Fresenius-Stiftung (2015-A197), et de la Faculté de médecine de la RWTH Aachen (RWTH Returner Program). V. G. P. est soutenu par des bourses de recherche de la Deutsche Gesellschaft fourrure Nephrologie, la Fondation Alexander von Humboldt, et le National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E est soutenu par la Fondation LeDucq. R. K. est soutenu par des subventions du DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), de l’État de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) et du Centre interdisciplinaire de recherche clinique de l’Université RWTH Dachen (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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