يسمح الجمع بين وضع العلامات على الأجسام المضادة، والمقاصة البصرية، والفحص المجهري الضوئي المتقدم، بإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد للهياكل أو الأجهزة الكاملة. يوصف هنا هو طريقة بسيطة للجمع بين وضع العلامات المناعية من شرائح الكلى سميكة، والمقاصة البصرية مع cinnamate إيثيل، والتصوير البؤري التي تمكن التصور والقياس الكمي للهياكل الكلوية ثلاثية الأبعاد.
تقنيات المقاصة البصرية تجعل الأنسجة شفافة عن طريق معادلة مؤشر الانكسار في جميع أنحاء عينة للتصوير الثلاثي الأبعاد اللاحقة (3-D). وقد حظيت باهتمام كبير في جميع مجالات البحوث لإمكانية تحليل الهياكل المجهرية متعددة الخلايا التي تمتد على مسافات العيان. وبالنظر إلى أن أنابيب الكلى، والأوعية الدموية، والأعصاب، وغطاء الكلى تمتد في العديد من الاتجاهات، والتي تم التقاطها جزئيا فقط من قبل التقنيات التقليدية ثنائية الأبعاد حتى الآن، وتطهير الأنسجة فتحت أيضا العديد من المجالات الجديدة لبحوث الكلى. قائمة أساليب المقاصة البصرية تنمو بسرعة، ولكن لا يزال من الصعب للمبتدئين في هذا المجال لاختيار أفضل طريقة لسؤال بحثي معين. شريطة هنا هو طريقة بسيطة تجمع بين وضع العلامات الأجسام المضادة من شرائح الكلى الماوس سميكة. (أ) التطهير البصري باستخدام الإيثيل الإيثيلي الرخيص وغير السام والجاهزة للاستخدام؛ والتصوير البؤري. يصف هذا البروتوكول كيفية بث الكلى واستخدام خطوة استرجاع مستضد لزيادة ربط الأجسام المضادة دون الحاجة إلى معدات متخصصة. يتم عرض تطبيقه في تصوير هياكل متعددة الخلايا مختلفة داخل الكلى، ويتم معالجة كيفية استكشاف الأخطاء وإصلاحها سوء اختراق الأجسام المضادة في الأنسجة. كما نناقش الصعوبات المحتملة في تصوير الفلوروفورس الذاتية والحصول على عينات كبيرة جدا وكيفية التغلب عليها. يوفر هذا البروتوكول البسيط أداة سهلة الإعداد وشاملة لدراسة الأنسجة في ثلاثة أبعاد.
وقد أدى الاهتمام المتزايد بدراسة أعضاء كاملة أو هياكل كبيرة متعددة الخلايا إلى تطوير أساليب التطهير البصري التي تنطوي على تصوير الأنسجة الشفافة في ثلاثة أبعاد. حتى وقت قريب، كانت أفضل الطرق لتقدير عدد الخلايا، وطول، أو حجم الهياكل كلها ستيريوي أو مقطع تسلسلي شامل، والذي يقوم على أخذ العينات النظامية من الأنسجة لتحليلها في وقت لاحق في بعدين1، 2 , 3– ومع ذلك، فإن هذه الأساليب تستغرق وقتاطويلا وتحتاج إلى مستوى عال من التدريب والخبرة 4. طرق المقاصة البصرية التغلب على هذه المشاكل عن طريق معادلة مؤشر الانكسار في جميع أنحاء عينة لجعل الأنسجة شفافة للتصوير 3-D5،6،7.
وقد تم تطوير عدة طرق للتطهير البصري تندرج في فئتين رئيسيتين: الأساليب القائمة على المذيبات والأساليب القائمة على مائي. يمكن تقسيم الأساليب المائية إلى غمربسيط 8،9،هايبرأوهدينغ10،11،وهيدروجيل التضمين12،13. الطرق القائمة على المذيبات تجفيف الأنسجة، وإزالة الدهون وتطبيع مؤشر الانكسار إلى قيمة حوالي 1.55. القيود المفروضة على معظم الأساليب القائمة على المذيبات هي تبريد الفلورة الذاتية من البروتينات مراسل شائعة الاستخدام مثل GFP، سمية المذيبات، والقدرة على حل الغراء المستخدمة في بعض غرف التصوير أو العدسات الموضوعية، وانكماش الأنسجة خلال الجفاف14،15،16،17،18،19،20،21. ومع ذلك، الطرق القائمة على المذيبات بسيطة، وكفاءة الوقت، ويمكن أن تعمل في عدد من أنواع الأنسجة المختلفة.
تعتمد الطرق المائية على غمر الأنسجة في الحلول المائية التي تحتوي على مؤشرات انكسار في نطاق 1.38-1.528و11و12و22و23و24 . وقد وضعت هذه الأساليب للحفاظ على انبعاث البروتين مراسل الفلورسنت الذاتية ومنع الانكماش الناجم عن الجفاف، ولكن القيود المفروضة على معظم أساليب المقاصة المائية تشمل مدة أطول من البروتوكول، وتوسيع الأنسجة، و تعديل البروتين (أي إزالة الصبغة الجزئية للبروتينات عن طريق اليوريا فيبروتوكولات ترطيب مفرط مثل ScaleA2) 7،11،23،25. تناول ScaleS توسع الأنسجة من خلال الجمع بين اليوريا مع السوربيتول، والتي توازن عن طريق الجفاف توسع الأنسجة الناجمة عن اليوريا، والحفاظ على البنية الفوقية للأنسجة كما تم تقييمها من قبل المجهر الإلكتروني10. يؤثر انكماش الأنسجة أو توسعها على الأحجام المطلقة للهياكل أو المسافات بين الكائنات أو كثافة الخلايا لكل وحدة تخزين. وبالتالي، فإن قياس التغيرات في الحجم عند إزالة الأنسجة قد يساعد على تفسير النتائج التي تم الحصول عليها7،26.
بشكل عام، يتكون بروتوكول التنظيف البصري من خطوات متعددة، بما في ذلك المعالجة المسبقة، ونفاذية، ووسم المناعة (إذا لزم الأمر)، ومطابقة مؤشر الانكسار، والتصوير مع الفحص المجهري الضوئي المتقدم (على سبيل المثال، اثنين من الفوتون، أو البؤرة، أو ضوء ورقة الفلورة المجهرية). وقد وضعت معظم نُهُج المقاصة لتصور الأنسجة العصبية، وقد أثبتت الدراسات الناشئة تطبيقها في أجهزة أخرى5. وقد ثبت من قبل هذه الأداة الشاملة للسماح بتحليل موثوق وفعال لهياكل الكلى، بما في ذلك الكلى27،28،التسلل المناعي28،الأوعية الدموية28،وشرائح الأنابيب 29، وهو نهج مثالي لتحسين فهم وظيفة الكبيبي والأنابيب إعادة عرض في الصحة والمرض.
ملخصة هنا هو طريقة تعتمد على المذيبات التي تجمع بين تلطيخ المناعة من أنابيب الكلى. التطهير البصري مع رخيصة، غير سامة، وجاهزة للاستخدام الكيميائية إيثيل سينامات (ECi)؛ والتصوير المجهري البؤري الذي يسمح بالتصور الأنبوبي الكامل والقياس الكمي. هذه الطريقة بسيطة، تجمع بين مستضد استرجاع شرائح الكلى مع تلطيخ الأجسام المضادة التجارية، ولا تتطلب معدات متخصصة، مما يجعلها في متناول معظم المختبرات.
وقد حظيت تقنيات التطهير البصري باهتمام واسع النطاق للتصور ثلاثي الأبعاد والقياس الكمي للتشريح المجهري في مختلف الأجهزة. هنا، تم الجمع بين طريقة المقاصة القائمة على المذيبات (ECi) مع وضع العلامات المناعية للتصوير ثلاثي الأبعاد للأنابيب الكاملة في شرائح الكلى. هذه الطريقة بسيطة وغير مكلفة و…
The authors have nothing to disclose.
T. S. بدعم من المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية DFG (332853055)، آخر Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197)، وكلية الطب في RWTH آخن (RWTH برنامج العائدين). V. G. P. بدعم من زمالات بحثية من دويتشه جيسيلشافت فور كلورولوجي، ومؤسسة ألكسندر فون هومبولدت، والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا. D. H. E بدعم من مؤسسة LeDucq. ويتلقى ر. ك. الدعم من المنح المقدمة من وزارة المالية (KR-4073/3-1 وSCHN1188/5-1 وSFB/TRR57 وSFB/TRR219) وولاية نورثراينويستفاليا (MIWF-NRW) والمركز المتعدد التخصصات للبحوث السريرية في جامعة RWTH Aachen (O3-11).
0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
HCl | Carl Roth | P074.1 | |
Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
Operating scissors | Merit | 97-272 | |
Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |