Summary

Coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicoli giganti

Published: April 30, 2019
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Summary

Dimostriamo la coltura unicellulare di batteri all’interno di vescicoli giganti (GV). I GV contenenti cellule batteriche sono stati preparati con il metodo di trasferimento delle goccioline e sono stati immobilizzati su una membrana sostenuta su un substrato di vetro per l’osservazione diretta della crescita batterica. Questo approccio può anche essere adattabile ad altre cellule.

Abstract

Abbiamo sviluppato un metodo per coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all’interno di vescicole giganti (GV). La coltura delle cellule batteriche è importante per comprendere la funzione delle cellule batteriche nell’ambiente naturale. A causa dei progressi tecnologici, varie funzioni delle cellule batteriche possono essere rivelate a livello di singola cellula all’interno di uno spazio confinato. I GV sono compartimenti sferici di micro-dimensioni composti da molecole lipidiche anfifili e possono contenere vari materiali, comprese le cellule. In questo studio, una singola cellula batterica è stata incapsulata in 10-30 GV con il metodo di trasferimento delle goccioline e i Env contenenti cellule batteriche sono stati immobilizzati su una membrana supportata su un substrato di vetro. Il nostro metodo è utile per osservare la crescita in tempo reale di singoli batteri all’interno dei GV. Abbiamo coltivato cellule di Escherichia coli (E. coli) come modello all’interno di GV, ma questo metodo può essere adattato ad altri tipi di cellule. Il nostro metodo può essere utilizzato nei campi scientifici e industriali della microbiologia, della biologia, della biotecnologia e della biologia sintetica.

Introduction

La coltura delle cellule batteriche a livello di singola cellula ha ricevuto una crescente attenzione. Coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all’interno di uno spazio ristretto può chiarire le funzioni batteriche come la variabilità fenotipica1,2,3,4, il comportamento cellulare5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9, e resistenza agli antibiotici10,11. A causa dei recenti progressi nelle tecniche di coltura, la coltura di singoli batteri può essere raggiunta all’interno di uno spazio confinato, come in un pozzo4,7,8, goccia di gel12,13 e gocciolatore acqua in olio (W/O)5,11. Per promuovere la comprensione o l’utilizzo di singole cellule batteriche, sono necessari ulteriori sviluppi tecnici delle tecniche di coltivazione.

Le vescicole che imitano la membrana cellulare biologica sono compartimenti sferici costituiti da molecole anfifile e possono contenere vari materiali. Le vesciche sono classificate in base alle dimensioni e includono piccole vesciche (SV, diametro < 100 nm), grandi vescicle (LV, 1 m). SV o LV sono comunemente utilizzati come portatori di droga a causa della loro affinità con la membrana cellulare biologica14. I GV sono stati utilizzati anche come sistema di reattori per la costruzione di protocelle15 o cellule artificiali16. L’incapsulamento di cellule biologiche in GV è stato segnalato17,18, e quindi i GV mostrano il potenziale come sistema di coltura cellulare quando combinati con il sistema del reattore.

Qui, insieme a un video di procedure sperimentali, descriviamo come i GV possono essere utilizzati come nuovi vasi di coltura cellulare19. I GV contenenti batteri sono stati realizzati con il metodo di trasferimento delle goccioline20 e sono stati poi immobilizzati su una membrana supportata su un vetro di copertura. Abbiamo usato questo sistema per osservare la crescita batterica a livello di singola cellula all’interno dei GV in tempo reale.

Protocol

1. Preparazione di GV contenenti cellule batteriche con il metodo di trasferimento goccia Preparare soluzioni di riserva lipididiche di 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in cloroformio/ soluzione di metanolo (2/1, v/v) e conservare il brodo a -20 gradi centigradi. Preparazione di una soluzione di olio contenente lipidi Versa…

Representative Results

Presentiamo un metodo semplice per generare GV contenenti singole cellule batteriche utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole (Figura 1). La figura 1a mostra un’immagine schematica della precipitazione di GV contenenti batteri. Le goccioline W/O contenenti batteri vengono trasferite attraverso l’interfaccia olio-acqua (strato di lipidi) dalla centrifugazione per formare i GV. La differenza di densità tra il saccaros…

Discussion

Qui, descriviamo un metodo per coltivare le cellule batteriche a livello di singola cellula all’interno dei GV. Questo semplice metodo prevede la formazione di GV contenenti cellule batteriche a livello di singola cellula utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole. Rispetto ad altri approcci per ottenere GV contenenti cellule batteriche, questo metodo presenta due vantaggi: (i) è facile da sviluppare e (ii) è necessario un piccolo volume (2 -L) della soluzione campione per preparare i GV. Il metodo di trasfe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da un’iniziativa leader per eccellenti giovani ricercatori (LEADER, n. 16812285) del Ministero dell’Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) del Giappone, un Grant-in-Aid per la ricerca sui giovani scienziati (n. 18K18157, 16K21034) dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) a M.M., e Grant-in-Aid da MEXT a K.K. (n. 17H06417, 17H06413).

Materials

Bactotryptone BD Biosciences 211705
Chloroform Wako Pure Chemicals 032-21921
Cover glass (18 × 18 mm) Matsunami Glass Ind. C018181 thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm) Matsunami Glass Ind. custom-order thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge Hi-Tech Co. ATT101 swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) Nitoms T4613
Glass vial AS ONE 6-306-01 Durham fermentation tube
Glucose Wako Pure Chemicals 049-31165
Inverted microscope Olympus IX-73
Methanol Wako Pure Chemicals 133-16771
Microscopic heating stage system TOKAI HIT TP-110R-100
Mineral oil Nacalai Tesque 23334-85
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610000
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Objective lens Olympus LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids 610005 pore size 100 nm
sCMOS camera Andor Zyla 4.2 plus
Sodium chloride Wako Pure Chemicals 191-01665
Sucrose Wako Pure Chemicals 196-00015
Ultrasonic bath AS ONE ASU-3D
Yeast extract BD Biosciences 212750
0.6 mL lidded plastic tube Watson 130-806C
1.5 mL lidded plastic tube Sumitomo Bakelite Co. MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline Avanti Polar Lipids 850457P POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids 880129P Biotin-PEG-DSPE

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Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).

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