Summary

Culture cellulaire bactérienne au niveau unicellulaire à l'intérieur des vésicules géantes

Published: April 30, 2019
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Summary

Nous démontrons la culture unicellulaire des bactéries à l’intérieur des vésicules géantes (GM). Les GV contenant des cellules bactériennes ont été préparés par la méthode de transfert de gouttelettes et ont été immobilisés sur une membrane soutenue sur un substrat en verre pour l’observation directe de la croissance bactérienne. Cette approche peut également être adaptable à d’autres cellules.

Abstract

Nous avons mis au point une méthode de culture des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l’intérieur des vésicules géantes (GV). La culture cellulaire bactérienne est importante pour comprendre la fonction des cellules bactériennes dans l’environnement naturel. En raison des progrès technologiques, diverses fonctions de cellules bactériennes peuvent être révélées au niveau d’une seule cellule à l’intérieur d’un espace confiné. Les VÉHICULES sont des compartiments sphériques de microtaille composée de molécules lipidiques amphiphiles et peuvent contenir divers matériaux, y compris des cellules. Dans cette étude, une seule cellule bactérienne a été encapsulée en 10 à 30 millions de véhicules par la méthode de transfert de gouttelettes et les GV contenant des cellules bactériennes ont été immobilisés sur une membrane supportée sur un substrat de verre. Notre méthode est utile pour observer la croissance en temps réel des bactéries simples à l’intérieur des VÉHICULES lourds. Nous avons cultivé des cellules Escherichia coli (E. coli) comme modèle à l’intérieur des GV, mais cette méthode peut être adaptée à d’autres types de cellules. Notre méthode peut être utilisée dans les domaines scientifiques et industriels de la microbiologie, de la biologie, de la biotechnologie et de la biologie synthétique.

Introduction

La culture des cellules bactériennes au niveau unicellulaire a reçu une attention croissante. Cultiver des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l’intérieur d’un espace confiné peut élucider des fonctions bactériennes telles que la variabilité phénotypique1,2,3,4, comportement cellulaire5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9, et résistance aux antibiotiques10,11. En raison des progrès récents dans les techniques de culture, la culture des bactéries simples peut être réalisée à l’intérieur d’un espace confiné, comme dans un puits-puce4,7,8, gouttelette de gel12,13 , et gouttelette d’eau dans l’huile (W/O)5,11. Pour promouvoir la compréhension ou l’utilisation de cellules bactériennes uniques, d’autres développements techniques des techniques de culture sont nécessaires.

Les vésicules qui imitent la membrane cellulaire biologique sont des compartiments sphériques composés de molécules amphiphiles et peuvent contenir divers matériaux. Les vésicules sont classées en fonction de leur taille et comprennent les petites vésicules (SVs, diamètre et 100 nm), les grandes vésicules (LV, ‘lt;1 ‘m) et les vésicules géantes (GV, ‘gt;1 ‘m). Les SV ou LVs sont couramment utilisés comme porteurs de médicaments en raison de leur affinité avec la membrane cellulaire biologique14. Les GV ont également été utilisés comme système de réacteur pour la construction de protocellules15 ou de cellules artificielles16. L’encapsulation des cellules biologiques dans les GV a été rapportée17,18, et donc les GV montrent le potentiel comme un système de culture cellulaire lorsqu’il est combiné avec le système de réacteur.

Ici, avec une vidéo des procédures expérimentales, nous décrivons comment les GV peuvent être utilisés comme nouveaux navires de culture cellulaire19. Les GV contenant des bactéries ont été fabriqués par la méthode de transfert de gouttelettes20 et ont ensuite été immobilisés sur une membrane supportée sur un verre de couverture. Nous avons utilisé ce système pour observer la croissance bactérienne au niveau unicellulaire à l’intérieur des VÉHICULES électriques en temps réel.

Protocol

1. Préparation de véhicules uvraux contenant des cellules bactériennes par la méthode de transfert de gouttelettes Préparer des solutions de stock lipidique de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) et 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (biotine-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) en chloroforme/ solution de méthanol (2/1, v/v) et stocker le bouillon à -20 oC. Préparation d’une solution d’huile contenant des lipides</…

Representative Results

Nous présentons une méthode simple pour générer des GV contenant des cellules bactériennes uniques en utilisant la méthode de transfert de gouttelettes (Figure 1). La figure 1a montre une image schématique des précipitations des VÉHICULES uvraux contenant des bactéries. Les gouttelettes W/O contenant des bactéries sont transférées à travers l’interface eau-huile (monocouche lipidique) par centrifugation pour former …

Discussion

Ici, nous décrivons une méthode pour cultiver des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l’intérieur des VÉHICULES lourds. Cette méthode simple consiste à former des GV contenant des cellules bactériennes au niveau unicellulaire en utilisant la méthode de transfert de gouttelettes. Par rapport à d’autres approches pour l’obtention de VÉHICULES uvrifs contenant des cellules bactériennes, cette méthode présente deux avantages : (i) elle est facile à développer, et (ii) un petit volume (2 l) de la …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une initiative de premier plan pour d’excellents jeunes chercheurs (LEADER, no 16812285) du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sports et de la Technologie (MEXT) du Japon, une subvention d’aide pour la recherche sur les jeunes scientifiques (No. 18K18157, 16K21034) de la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) à M.M., et Grant-in-Aid de MEXT à K.K. (No. 17H06417, 17H06413).

Materials

Bactotryptone BD Biosciences 211705
Chloroform Wako Pure Chemicals 032-21921
Cover glass (18 × 18 mm) Matsunami Glass Ind. C018181 thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm) Matsunami Glass Ind. custom-order thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge Hi-Tech Co. ATT101 swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) Nitoms T4613
Glass vial AS ONE 6-306-01 Durham fermentation tube
Glucose Wako Pure Chemicals 049-31165
Inverted microscope Olympus IX-73
Methanol Wako Pure Chemicals 133-16771
Microscopic heating stage system TOKAI HIT TP-110R-100
Mineral oil Nacalai Tesque 23334-85
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610000
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Objective lens Olympus LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids 610005 pore size 100 nm
sCMOS camera Andor Zyla 4.2 plus
Sodium chloride Wako Pure Chemicals 191-01665
Sucrose Wako Pure Chemicals 196-00015
Ultrasonic bath AS ONE ASU-3D
Yeast extract BD Biosciences 212750
0.6 mL lidded plastic tube Watson 130-806C
1.5 mL lidded plastic tube Sumitomo Bakelite Co. MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline Avanti Polar Lipids 850457P POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids 880129P Biotin-PEG-DSPE

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Cite This Article
Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).

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