In vivo üç boyutlu Iki-foton mikroskobu çalışma bir cam mikro-pipet kullanarak yerel ATP ejeksiyon tarafından vasküler tepkiler yürütülen eğitim
Summary
Cam mikro-pipet ve hızlı iki foton hyperstack görüntüleme yöntemi kullanarak optimize edilmiş bir yerel fırlatma prosedürü sunacağız, bu da kapiller çapı değişikliklerinin hassas ölçümünü ve yönetmeliğinin üç boyutta araştırmasını sağlar.
Abstract
Normal beyin fonksiyonunun bakımı, karmaşık bir damar ağı ile yeterli ve verimli oksijen ve beslenme kaynağı gerektirir. Ancak, serebral kan akışının düzenlenmesi (CBF), özellikle kapiller düzeyinde tamamen anlaşılır. İki foton mikroskopisi, CBF ve yönetmeliğinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan güçlü bir araçtır. Şu anda bu alan, üç boyuttaki (2) CBF yanıtlarının incelenmesi (1) in vivo iki foton mikroskopi çalışmaları eksikliği ile sınırlıdır ve (3) vasküler ağ içinde lokalize müdahalelerdir. Burada, bir cam mikro-pipet ile ATP yerel ejeksiyon tarafından yapılmıştır vasküler tepkiler yürütülen incelemek için iki foton mikroskopisi kullanarak bir 3D in vivo yöntemi tarif. Yöntemimiz, elde edilen görüntülerin maksimal yoğunluk projeksiyonu ile hassas çap ölçümleri sağlayan hızlı ve tekrarlayan hiperyığın iki foton görüntüleme kullanır. Ayrıca, bu yöntem de 3D astrositik kalsiyum tepkiler okumak için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca cam mikro-pipet ekleme ve iki foton hyperstack görüntüleme avantajları ve sınırlamaları tartışıyoruz.
Introduction
Beynin yüksek enerji tüketimi oranı vardır. Yaklaşık 20% oksijen ve 25% insan vücudu tarafından tüketilen glikoz beyin işlevine adamıştır, beyin sadece kaplar ise toplam vücut kütlesi% 2. Normal beyin fonksiyonunun bakımı, karmaşık bir damar ağında kan akışı ile yeterli ve verimli oksijen ve beslenme kaynağı gerektirir. Yerel beyin aktivitesi ve serebral kan akımı (CBF) nöronlar, astrositler, perikayt, pürüzsüz Kas hücreleri (smcs) ve endotel hücreler (ECS)1fonksiyonel özelliklerine bağlı olarak, sağlam birleştiğinde. Son zamanlarda, penetran arterioller dallanma kapiller ilk birkaç sipariş bir ‘ hotspot ‘2olarak ortaya çıktı, kılcal kan akışının aktif düzenleme gösteren. Yavaş yürütülen damar tepkisi (CVR) bu ‘ hotspot ‘, fare somatoduyusal korteks hem bıyık stimülasyon ve yerel ejeksiyon (PU,) ATP bir cam mikro-pipet3sırasında keşfedilen.
İki foton lazer tarama floresan mikroskopisi tarafından In vivo görüntüleme yaygın serebral korteks nörovasküler tepkiler okuyan için kullanılan olmasına rağmen, çalışmaların çoğu kan damar çapları ölçülen ve bir içinde düzenlemeleri incelenmiştir iki boyutlu (2D) x-y düzlem. Zorluklar şunlardır: Öncelikle, serebral kan damarlarında ve onların kucaklayan astrositler, perikayt ve SMCs üç boyutlu (3D) dalları inşa. Bu nedenle 3D etkileşimlerini incelemek çok önemlidir. İkincisi, odak kayması bile küçük bir miktar hem gemi çapları ve hücresel floresan sinyalleri kesin ölçümü etkiler. Son olarak, CVR ‘Ler üç boyutta hızlı ve uzak bir şekilde ulaşmaktadır. 3B ses taraması, CVR ‘Ler tespit etmek ve mekanizmalarını açıklama için idealdir. Fare somatoduyusal korteks in vivo çalışması için iki foton mikroskop içinde bir piezo motor amacı uyguladık, elde edilen görüntülerin maksimal yoğunluk projeksiyonlarına göre hassas çap ölçümleri sağlar.
Cam mikro-pipetler sık olarak in vivo beyin çalışmaları için kullanılan, örneğin, toplu yük organik boyalar4, kayıt EEGs5 ve yama sıkma6. Yine de, sınırlamalar kalır. Yaygın olarak, cam mikro-pipet ucu hassas bir şekilde yerleştirilir, ya da mikro-pipet yerel girişimler için kullanılmaz. Burada, mikro-pipet ekleme ve yerel fırlatma prosedürünü optimize ettik.
Ayrıca, 3D iki foton mikroskobu ve genetik olarak kodlanmış floresan göstergeleri kombinasyonu bir 3D kapsamda nörovasküler kavrama araştırmak için eşsiz bir fırsat sunuyor. Bu çalışmada, bu ve enjekte viral vektörler astrosit spesifik genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri fare somatoduyusal korteks içine taşıyan yararlandı. Astrositler yanı sıra damar çapları farklı floresan işaretçileri birleştirerek aynı anda görüntülenmiş.
Genel olarak, cam mikro-pipet ve hızlı iki foton hyperstack görüntüleme ile yerel ejeksiyon (şişirme) için optimize edilmiş bir yöntem sunuyoruz, bu da kılcal çap değişikliklerinin kesin ölçümünü sağlar. Buna ek olarak, bizim yöntemi aynı anda astrositler ve vasküler çap Tepkiler CA2 + tepkiler 3D profilleri incelemek için yeni bir araç sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Damar çalışmaları için bir zorluk damar çapları kesin ölçümdür. Burada tarif ettiğimiz Yöntem, iki foton mikroskobu ile hızlı ve tekrarlayan hiperyığın görüntüleme yapmak için motorlu bir piezo amaç kullandı. İlk olarak, bu yöntem penetran arteriol, 1St sipariş ve 2ND sipariş kılcal odak kaybı olmadan tekrarlı sınavlar sağlar ve yavaşça kapillaries in vivo içinde vasküler tepkiler yürütülen keşif yol açtı. İkincisi, bir viral vektör enjeksiyon tekniği il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Lundbeck Vakfı, NOVO-Nordisk Vakfı, Danimarka bağımsız araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir | Tıbbi Bilimler, ve NORDEA Vakfı Hibe sağlıklı yaşlanma merkezi.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
