In Vivo microscopia bidimensionale bidimensionale per studiare le risposte vascolari mediante l'espulsione locale dell'ATP utilizzando una micropipetta di vetro
Summary
Vi presentiamo una procedura di espulsione locale ottimizzata utilizzando una micro-pipetta di vetro e un metodo di imaging iperpilato a due fotoni veloce, che consente una misurazione precisa dei cambiamenti di diametro capillare e l’analisi della sua regolazione in tre dimensioni.
Abstract
La manutenzione della normale funzione cerebrale richiede una fornitura sufficiente ed efficiente di ossigeno e nutrizione da parte di una complessa rete di vasi. Tuttavia, la regolazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) è incompletamente compresa, soprattutto a livello capillare. La microscopia a due fotoni è un potente strumento ampiamente utilizzato per studiare la CBF e la sua regolazione. Attualmente, questo campo è limitato dalla mancanza di studi in vivo sulla microscopia a due fotoni che esaminano (1) le risposte CBF in tre dimensioni, (2) hanno condotto risposte vascolari e (3) interventi localizzati all’interno della rete vascolare. Qui, descriviamo un metodo 3D in vivo usando la microscopia a due fotoni per studiare le risposte vascolari condotte provocare l’espulsione locale dell’ATP con una micropipetta di vetro. Il nostro metodo utilizza immagini iperimpilate a due fotone veloci e ripetitive, fornendo misurazioni precise del diametro mediante la proiezione dell’intensità massima delle immagini ottenute. Inoltre, mostriamo che questo metodo può essere utilizzato anche per studiare le risposte di calcio astrocitico 3D. Discutiamo anche dei vantaggi e dei limiti dell’inserimento di micropipe in vetro e dell’imaging iperstack a due fotoni.
Introduction
Il cervello ha un alto tasso di consumo di energia. Circa il 20% dell’ossigeno e il 25% del glucosio consumato dal corpo umano sono dedicati alla funzione cerebrale, mentre il cervello occupa solo il 2% della massa corporea totale. Il mantenimento della normale funzione cerebrale richiede un apporto sufficiente ed efficiente di ossigeno e nutrizione da flusso sanguigno in una complessa rete di vasi. L’attività cerebrale locale e il flusso sanguigno cerebrale (CBF) sono robustamente accoppiati, a seconda delle proprietà funzionali di neuroni, astrociti, periciti, cellule muscolari lisce (SMC) e cellule endoteliali (EC)1. Recentemente, i primi ordini di capillari che si ramificano dalle arteriole penetranti sono emersi come un ‘hotspot’2, che mostra la regolazione attiva del flusso sanguigno capillare. Una risposta vascolare lenta condotta (CVR) è stata scoperta in questo ‘hotspot’ nella corteccia somatosensoriale del topo sia durante la stimolazione del baffo che l’espulsione locale (puffing) di ATP con una micro-pipetta di vetro3.
Sebbene l’imaging in vivo mediante microscopia fluorescente a scansione laser a due fotoni sia stato ampiamente utilizzato per studiare le risposte neurovascolari nella corteccia cerebrale, la maggior parte degli studi ha misurato i diametri dei vasi sanguigni e ne ha studiato la regolazione in un piano x-y bidimensionale (2D). Le sfide sono: in primo luogo, i vasi sanguigni cerebrali e la loro adozione di astrociti, periciti e SMC costruiscono rami in tre dimensioni (3D). È quindi fondamentale studiare le loro interazioni in 3D. In secondo luogo, anche una piccola quantità di deriva a fuoco influenzerà la misurazione precisa sia dei diametri dei vasi che dei segnali fluorescenti cellulari. Infine, i CCR sono veloci e di vasta portata in tre dimensioni. La scansione del volume 3D è ottimale per rilevare i CCR e svelare i loro meccanismi. Abbiamo implementato un obiettivo motorio piezoso in un microscopio a due fotoni per studiare la corteccia somatosensoriale dei topi in vivo, consentendo misurazioni precise del diametro mediante proiezioni di intensità massima delle immagini ottenute.
Le micropipe in vetro sono state spesso utilizzate per studi sul cervello in vivo, ad esempio per caricare alla rinfusa coloranti organici4, registrare EEG5 e per il bloccaggio delle patch6. Tuttavia, permangono delle limitazioni. Comunemente, la punta della micro-pipetta di vetro è posizionata in modo incontuoso, o la micro-pipetta non viene utilizzata per interventi locali. Qui, abbiamo ottimizzato la procedura di inserimento di micro-pipette e espulsione locale.
Inoltre, la combinazione di microscopia 3D a due fotoni e indicatori fluorescenti geneticamente codificati offre un’opportunità senza precedenti di studiare l’accoppiamento neurovascolare in un ambito 3D. In questo studio, abbiamo approfittato di questo e iniettato vettori virali che trasportano indicatori di calcio geneticamente codificati specifici dell’astrocite nella corteccia somatosensoriale del topo. Gli astrociti e i diametri dei vasi sono stati immagini simultaneamente combinando diversi marcatori fluorescenti.
Nel complesso, presentiamo un metodo ottimizzato di espulsione locale (puffing) da micro-pipetta di vetro e imaging veloce per iperpilati a due fotoni, che consente una misurazione precisa dei cambiamenti di diametro capillare. Inoltre, il nostro metodo fornisce un nuovo strumento per studiare contemporaneamente i profili 3D delle risposte Ca2 in astrociti e risposte di diametro vascolare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una sfida per gli studi vascolari è la misurazione precisa dei diametri dei vasi. Il metodo che qui descriviamo ha usato un obiettivo di piezo motorizzato per creare immagini iperimpilate veloci e ripetitive mediante microscopia a due fotoni. In primo luogo, questo metodo consente ripetuti esami dell’arteriola penetrante, 1st ordine e 2nd ordine capillari senza perdita di messa a fuoco e ha portato alla scoperta di risposte vascolari lentamente condotte nei capillari in vivo. In secondo luogo, in c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Lundbeck, dalla NOVO-Nordisk Foundation, dal Danish Council for Independent Research. Scienze Mediche, e la Fondazione NORDEA Grant al Centro per l’invecchiamento sano.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
