유리 마이크로 파이펫을 사용하여 국소 ATP 배출에 의한 혈관 반응을 연구하기 위한 Vivo 3차원 2차원 광자 현미경 검사법
Summary
우리는 유리 마이크로 파이펫과 빠른 2 광자 하이퍼 스택 이미징 방법을 사용하여 최적화 된 국소 배출 절차를 제시하여 모세관 직경 변화를 정밀하게 측정하고 3 차원으로 조절을 조사 할 수 있습니다.
Abstract
정상적인 뇌 기능의 유지 보수혈관의 복잡한 네트워크에 의해 산소와 영양의 충분하고 효율적인 공급이 필요합니다. 그러나, 대뇌 혈류량의 규칙 (CBF)는 불완전하게 이해됩니다, 특히 모세관 수준에서. 2 광자 현미경 검사법은 CBF와 그것의 규정을 공부하기 위하여 널리 이용된 강력한 공구입니다. 현재, 이 분야는 (1) CBF 반응을 3차원으로 검사하는 생체내 2광자 현미경 연구의 부족, (2) 혈관 반응 및 (3) 혈관 네트워크 내의 국소적 개입에 의해 제한된다. 여기서, 우리는 유리 마이크로 파이펫으로 ATP의 국소 배출에 의해 유도된 실시된 혈관 반응을 연구하기 위해 2광자 현미경을 사용하여 생체 내 3D 방법을 설명합니다. 우리의 방법은 얻어진 심물의 최대 강도 투영에 의하여 정확한 직경 측정을 제공하는 빠르고 반복적인 하이퍼스택 2 광자 화상 진찰을 이용합니다. 또한, 우리는이 방법은 또한 3D 성상 성상 칼슘 응답을 연구하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 또한 유리 마이크로 파이펫 삽입 및 2광자 하이퍼스택 이미징의 장점과 한계에 대해서도 논의합니다.
Introduction
뇌는 높은 에너지 소비율을 가지고 있습니다. 산소의 약 20%와 인체가 소비하는 포도당의 25%는 뇌 기능에 전념하고 있으며, 뇌는 전체 체질량의 2%만 차지합니다. 정상적인 뇌 기능의 유지 보수 혈관의 복잡 한 네트워크에서 혈액 흐름에 의해 산소와 영양의 충분 하 고 효율적인 공급을 필요 합니다. 국소 뇌 활동 및 대뇌 혈류(CBF)는 뉴런, 성상세포, 회수세포, 평활근 세포(SMC) 및 내피 세포(ECs)의 기능적 특성에 따라 강력하게 결합된다1. 최근에는 관통하는 동맥에서 분지하는 모세혈관의 처음 몇 가지 주문이‘핫스팟’2로 등장하여 모세 혈관 의 혈류에 대한 적극적인 조절을 보여주고 있습니다. 느린 전도 혈관 반응 (CVR)은 유리 마이크로 파이펫3와ATP의 수염 자극 및 국소 배출 (퍼핑) 동안 마우스 체감각 피질에서이 ‘핫스팟’에서 발견되었다.
2 광자 레이저 스캐닝 형광 현미경 검사법에 의한 생체 내 이미징은 대뇌 피질의 신경 혈관 반응을 연구하는 데 널리 사용되어 왔지만, 대부분의 연구는 혈관 직경을 측정하고 그들의 규정을 조사했습니다. 2차원(2D) x-y 평면. 과제는 첫째, 대뇌 혈관과 성상 세포, pericytes 및 SMC를 포용하는 것이 3 차원 (3D)로 분기를 구성합니다. 따라서 3D로 상호 작용을 연구하는 것이 중요합니다. 둘째, 소량의 초점도 혈관 직경과 세포 형광 신호의 정확한 측정에 영향을 미칩니다. 마지막으로, C버는 3차원으로 빠르고 광범위합니다. 3D 볼륨 스캐닝은 CR을 감지하고 메커니즘을 공개하는 데 최적입니다. 우리는 생체 내에서 마우스 체감각 피질을 연구하기 위해 2 광자 현미경으로 압전 모터 목표를 구현하여 얻은 이미지의 최대 강도 투영으로 정확한 직경측정을 가능하게 했습니다.
유리 마이크로 파이펫은 생체 내 뇌 연구에 자주 사용되어 왔다, 예를 들어,대량 로드 유기 염료 4, 기록 EEGs5 및 패치 클램핑6. 그럼에도 불구하고 제한은 남아 있습니다. 일반적으로 유리 마이크로 파이펫의 팁이 부정확하게 배치되거나 마이크로 파이펫이 국소 개입에 사용되지 않습니다. 여기서는 마이크로 파이펫 삽입 및 국소 배출 절차를 최적화했습니다.
또한 3D 2광자 현미경 검사법과 유전자 부호인형 형광 지표의 조합은 3D 범위에서 신경 혈관 커플링을 조사할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다. 이 연구에서, 우리는 이것을 이용하고 마우스 체감각 피질로 성상 세포 특정 유전자 부호화 한 칼슘 지표를 운반하는 바이러스 벡터를 주입했습니다. 성상 세포뿐만 아니라 혈관 직경은 다른 형광 마커를 결합하여 동시에 이미지화되었다.
전반적으로, 우리는 유리 마이크로 파이펫과 모세관 직경 변화를 정밀하게 측정 할 수있는 빠른 2 광자 하이퍼 스택 이미징에 의한 국소 배출 (퍼핑)의 최적화 된 방법을 제시합니다. 또한, 우리의 방법은 성상 세포 및 혈관 직경 응답에서 Ca2+ 응답의 3D 프로파일을 동시에 연구할 수 있는 새로운 도구를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈관 연구의 한 가지 과제는 혈관 직경의 정확한 측정입니다. 여기에서 설명하는 방법은 2 광자 현미경 검사법에 의하여 빠르고 반복적인 hyperstack 화상 진찰을 만들기 위하여 전동된 압전 목표를 이용했습니다. 첫째, 이 방법은 초점의 손실없이 관통 동맥, 1st 순서 및 2차 모세 혈관의 반복 검사를 허용하고 생체 내에서 모세 혈관 반응을 천천히 실시의 발견으로 이어졌다. 둘째, 바…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 룬드벡 재단, NOVO-Nordisk 재단, 덴마크 독립 연구 위원회의 지원을 받았습니다 | 의료 과학, 그리고 건강한 노화 센터에 NORDEA 재단 보조금.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
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