여기에서, 우리는 화학요법 유도한 점막염의 모형을 사용하여 소장 상해 및 보상 과증식의 중요한 종점 그리고 증식 마커를 설치하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 세포 주기 특정 마커를 사용하여 작은 장 무게, 토굴 깊이 및 융모 높이를 엔드포인트로 사용하여 증식 세포의 검출을 입증합니다.
장 적응은 외상으로 인해 창자를 잃을 때 발생하는 자연적인 보상 메커니즘입니다. 토굴 세포 증식 및 증가된 영양소 흡수와 같은 적응 반응은 회복에 매우 중요하지만 제대로 이해되지 않습니다. 적응 반응 뒤에 분자 기계장치를 이해하는 것은 적응을 강화하기 위하여 양분 또는 약의 확인을 촉진하기 위하여 중요합니다. 문헌 전반에 걸쳐 다양한 접근법과 모델이 설명되었지만, 재현 가능한 데이터를 얻기 위해서는 절차를 본질적으로 수행하는 상세한 설명 방법이 필요합니다. 여기서, 우리는 마우스에서 화학요법 유도 점막염의 모형을 사용하여 소장 상해 및 보상 과증식의 중요한 종점 및 증식 마커를 추정하는 방법을 기술합니다. 우리는 세포 주기 특정 마커를 사용하여 증식 세포의 검출뿐만 아니라, 엔드 포인트로 소장 무게, 토굴 깊이 및 융모 높이를 사용하여 보여줍니다. 설명된 방법 내의 중요한 단계 중 일부는 소장의 제거 및 계량과 이 기술의 측정을 위해 제안된 다소 복잡한 소프트웨어 시스템입니다. 이러한 방법은 시간이 많이 걸리지 않으며 비용 효율적이고 수행하기 쉽고 측정하기 쉽다는 장점이 있습니다.
장 적응은 질병 이나 수술로 인해 창 자를 잃었을 때 발생 하는자연 보상 메커니즘 1,2. 외상 후, 창자는 세포 증식 및 증가 된 영양소 흡수를 특징으로하는형태 및 기능적 적응 반응을 겪습니다 3. 이 단계는 복구에 중요 하지만 제대로 이해. 장 적응 반응의 실험 연구는 마우스, 쥐 및 돼지에서 작은 창자 절제 후 발생하는 변화에 초점을 맞추고 있지만, 다른 종류의 부상 (예 : 화학적)에서 적응 반응 뒤에 분자 메커니즘을 이해 또는 세균)은 적응을 향상시키기 위해 영양소 또는 약물의 식별을 용이하게하는 데 중요합니다. 실험적으로, 다른 접근은 조직 병리학 적인 점수를 포함하여 소장 병리학의 복잡한 분자 및 세포 색인을 기술하기 위하여 이용되었습니다 상해의 결과를 측정하. 그럼에도 불구하고, 문헌에서 없는 것은 재현 가능한 데이터를 얻는 데 필요한 절차를 수행하는 방법에 대한 자세한 설명입니다. 창자 호르몬과 같은 적응에 관여하는 요인을 식별할 때, 쉽고, 저렴한 비용, 그리고 재현 가능한 동물 모형은 보증되고 여기에서 우리는 화학요법 유도한 장 점막염 (CIM)의 모형을 사용하여 건의합니다.
부상과 적응의 가장 간단하고 매우 유익한 끝점 중 하나는 소장 (SI)의 질량을 측정하는 것입니다. 우리는 점막염의 특징이 장세포의 세포증, 시간에 의존하는 융모 위축 및 감소 된 유사분열이라는 것을 알고 있습니다. 따라서 장 형태를 검사하는 것은 전임상 모델4,5에서매우 관련이 있습니다. 인간에서, 플라즈마 시트룰린의 감소, 기능 장세포의 마커, 독성 점수및 염증 마커와 상관 관계6 흡수 용량 이외에7, 이 아미노산은 우수한 바이오 마커제안 점막염. 시트룰린은 마우스와 래트 둘 다에서 측정될 수 있으며, 융모 길이8,토굴 생존9, 및 방사선 유도 점막염10과우수한 상관관계를 나타내고 있다.
플라즈마 시트룰린 측정의 주요 장점은 한 동물에게서 반복측정을 수집하는 능력입니다. 그러나, 마우스에 있는 다중 혈액 샘플링은 6 μL/g/week의 총 혈액 양으로 제한되고 전신 마취를 요구합니다. 이것은 불행하게도 또한 마우스에 있는 시트룰린 측정의 사용을 제한합니다. 또한, 시트룰린의 측정은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리는 고성능 액체 크로마토그래피11,12를필요로 합니다. 최근, 우리는 쥐의 시트룰린 수준이 SI 중량 (p < 0.001)(미공개 데이터)과 유의하게 상관 관계가 있음을 보여주었으며, 시트룰린은 장세포 질량을 반영하는 직접 측정을 합니다. SI 중량의 측정에 대한 제한은 마우스가 희생될 필요성이며 따라서 동일한 마우스 내에서 반복된 측정이 불가능합니다. 여전히 이 방법은 연구 질문에 대한 다양한 다른 조직 분석을 수행할 수 있는 가능성을 제공하며, 이러한 사실은 동물의 추가 사용을 만회할 수 있습니다. 따라서 우리는 SI 무게를 마우스의 부상과 적응의 쉽고 저렴한 비용으로 빠른 바이오마커로 사용하는 것이 좋습니다. 재현성과 허용 가능한 분석 적 변화를 보장하기 위해 내장은 동물에서 조심스럽게 제거하고 식염수로 씻어 내고 비우고 계량하기 전에 건조해야합니다. 이 문서에서는 이 절차가 수행되는 방법을 정확하게 보여 주시겠습니다.
점막염의 또 다른 특징은 토굴에서 증식 세포의 손실과 재생 기간 동안 보상 과증식3입니다. 세포 마커 Ki67은 면역 조직 화학13에의해 빠른 증식 세포를 결정하기 위해 자주 사용되어 왔다. Ki67은 증식의 단순한 마커이지만, Ki67이 세포 주기(G1, S, G2 및 M)의 모든 활성 단계동안 존재하기 때문에 부정확성(14)을 갖는다. 특정 라벨링은 복제 세포를 검출하는 데 필수적이며, 이는 우리가 S 상15에서복제 세포로 크게 제한되기 때문에 티미딘의 합성 유사체인 5-브로모-2′-데옥시우리딘(BrdU)의 situ 혼입에 제안하는 이유입니다. BrdU는 희생하기 150분 전에 동물에 주입되고 세포는 BrdU 특이적 항체를 사용하여 면역히스토화학으로 이후에 검출될 수 있다. 이 방법 문서에서는, 우리는 자유 이미지 소프트웨어를 사용하여 토굴 내의 BrdU 면역 양성 세포의 면적을 측정하는 방법을 정확하게 보여줍니다.
형태학적 및 기능적 변화는 종종 5-FU 유도 점막염 모델에서 연구되며, 장 적응은 융모 높이와 토굴 깊이에 의해 평가됩니다. 이 연구 기간 동안, 우리는 상해 단계와 동일한 점막염의 급성 기 동안 BrdU 통합으로 측정 된 증식이 토굴 깊이와 상관되지 않는다는 것을 발견했습니다. 이와 는 대조적으로, 토굴 깊이는 점막염의 수리 단계에서 볼 수있는 증식과 크게 상관 관계가 있으며, 유도 후 3 ~ 5 일. 이것은 점막염의 급성 단계가 혼자 토굴 깊이에 의해 측정할 수 없다는 것을 건의합니다. 우리는 점막염 마우스의 급성 단계에서 종점으로 증식을 사용하는 경우, BrdU 통합이 바람직하게는 사용되어야하지만, 재생 단계 동안 후기 단계에서 과확산을 정량화 할 때, 토굴 깊이는 합리적인 것이 좋습니다 BrdU 설립에 대한 대안. 이 연구의 목표는 종양학 분야뿐만 아니라 특히 장 손상 모델에 익숙하지 않은 모든 연구자에 의해 사용될 수있는 방식으로이 모델을 설명하는 것이었습니다.
기재된 모델은 체중, SI 중량 및 토굴 깊이를 엔드포인트로 사용하는 적응반응에 따라 형질전환 모델을 표현하기 위해 사용될 수 있다. 일례로, 우리는 5-플루오로라실(5-FU)의 유도 점막염의 모델을 세포에서 부족한 L 세포 분비(16)를 가진 모델을 노크하는 방법을 보여준다. 글루카곤형 펩타이드-1(GLP-1) 및 글루카곤형 펩티드-2(GLP-2)는 음식 섭취량에 반응하여 장내 내분비 L세포로부터 공동 분비되는 장호르몬이다(17,18). GLP-2는 장 치유, 점막 세포자멸의 조절 및 SI19,20,21,22의장벽 기능 의 개선을위한 중요한 요소로 인식되고 있습니다. 문헌에 근거하여, 우리는 내인성 호르몬이 상해 후에 적응 반응에서 일어나는 보상 과증식을 위해 필수적이다는 것을 가설을 세워.
여기서, 우리는 마우스 모델에서 SI 부상 및 재생을 연구하기 위해 널리 접근 가능한 방법을 입증한다. 장 손상의 다양한 전임상 동물 모델이 존재하지만, 각 모델이 고유하고 끝점이 연구 질문에 대답하는 것이 적절해야 한다는 것을 이해하는 것이 중요합니다. 이 모델은 부상에 대한 적응 반응을 연구하는 것이 우수하지만 점막염의 전 임상 모델로 모델을 사용할 때 끝점을 수정해야합니다. 그러…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 기본 신진 대사 연구를위한 노보 노디스크 센터와 룬드벡 재단의 무제한 보조금에 의해 지원되었다.
5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |