هنا، نقدم بروتوكول ًا لإنشاء نقاط نهاية هامة وعلامات انتشار للإصابات المعوية الصغيرة والانتشار المفرط التعويضي باستخدام نموذج من التهاب المخاطية الناجم عن العلاج الكيميائي. نقوم بإظهار الكشف عن الخلايا المنتشرة باستخدام علامة محددة دورة الخلية واستخدام الوزن المعوي الصغير، وعمق سرداب، وارتفاع الزغب كنقاط نهاية.
التكيف المعوي هو الآلية التعويضية الطبيعية التي تحدث عندما يتم فقدان الأمعاء بسبب الصدمة. الاستجابات التكيفية، مثل انتشار خلايا سرداب وزيادة امتصاص المغذيات، هي حاسمة في الانتعاش، ولكن سوء الفهم. إن فهم الآلية الجزيئية الكامنة وراء الاستجابات التكيفية أمر بالغ الأهمية لتيسير تحديد المغذيات أو الأدوية لتعزيز التكيف. وقد وُصفت نُهج ونماذج مختلفة في جميع الكتابات، ولكن هناك حاجة إلى طريقة وصفية مفصلة لتنفيذ الإجراءات أساساً للحصول على بيانات قابلة للاستنساخ. هنا، نقوم بوصف طريقة لتقدير نقاط النهاية الهامة وعلامات التكاثر من الإصابات المعوية الصغيرة وفرط الانتشار التعويضي باستخدام نموذج من التهاب المخاطية الناجم عن العلاج الكيميائي في الفئران. نقوم بإظهار الكشف عن الخلايا المنتشرة باستخدام علامة محددة دورة الخلية، وكذلك استخدام الوزن المعوي الصغير، وعمق سرداب، وارتفاع الزغب كنقاط نهاية. بعض الخطوات الحرجة ضمن الطريقة الموصوفة هي إزالة ووزن الأمعاء الدقيقة ونظام البرمجيات المعقدة إلى حد ما المقترحة لقياس هذه التقنية. ولهذه الأساليب مزايا أنها لا تستغرق وقتا طويلا، وأنها فعالة من حيث التكلفة وسهلة التنفيذ والقياس.
التكيف المعوي هو الآلية التعويضية الطبيعية التي تحدث عندما يتم فقدان الأمعاء بسبب المرض أو الجراحة1،2. بعد الصدمة، تخضع القناة الهضمية لاستجابة متكيفة مورفومترية ووظيفية، تتميز بانتشار خلايا سرداب وزيادة امتصاص المغذيات3. وهذه الخطوة حاسمة في الانتعاش، ولكنها غير مفهومة فهما جيدا. ركزت الدراسات التجريبية للاستجابة التكيفية المعوية على التغيرات التي تحدث بعد استئصال الأمعاء الدقيقة في الفئران والجرذان والخنازير، ولكن فهم الآلية الجزيئية وراء الاستجابة التكيفية في أنواع أخرى من الإصابات (على سبيل المثال، الكيميائية أو البكتيرية) أمر بالغ الأهمية لتسهيل تحديد المواد الغذائية أو الأدوية لتعزيز التكيف. من الناحية التجريبية، تم استخدام نهج مختلفة لوصف المؤشر الجزيئي والخلوي المعقد للأمراض المعوية الصغيرة، بما في ذلك تسجيل الأنسجة المرضية وقياس نتيجة الإصابة. وعلى الرغم من ذلك، فإن ما هو غائب عن المؤلفات هو وصف مفصل لكيفية تنفيذ الإجراءات اللازمة للحصول على بيانات قابلة للاستنساخ. عند تحديد العوامل التي تنطوي على التكيف، مثل هرمونات الأمعاء، ونموذج حيواني سهل ومنخفض التكلفة، واستنساخه له ما يبرره وهنا نقترح استخدام نموذج من التهاب المخاطية المعوية الناجم عن العلاج الكيميائي (CIM).
واحدة من أبسط ونقاط النهاية بالمعلومات جدا من كل من الإصابة والتكيف هو قياس كتلة الأمعاء الدقيقة (SI). ونحن نعلم أن السمة المميزة لداء المخاطية هو المبرمج من الخلايا المعوية، ضمور الزغب تعتمد على الوقت وانخفاض ميتوسيس. لذلك، فحص مورفولوجيا الأمعاء ذات الصلة للغاية في نماذج ما قبل السريرية4،5. في البشر، وانخفاض في citrulline البلازما، علامة على الخلايا المعوية تعمل، ويرتبط مع درجات السمية وعلامات التهابية6 بالإضافة إلى القدرة الاستيعابية7،مما يشير إلى أن هذه الأحماض الأمينية هي علامة حيوية ممتازة من الغشاء المخاطي. يمكن قياس Citrulline في كل من الفئران والفئران، وأظهرتارتباطات ممتازة مع طول الزغب 8، والبقاء على قيد الحياة سرداب9،والغشاء المخاطي الناجم عن الإشعاع10.
ميزة رئيسية لقياس citrulline البلازما هو القدرة على جمع القياسات المتكررة من أحد الحيوانات. ومع ذلك، يقتصر أخذ عينات الدم متعددة في الفئران على حجم الدم الكلي من 6 μL/g/week ويتطلب التخدير العام. وهذا للأسف يحد أيضا من استخدام قياسات سيترولين في الفئران. وعلاوة على ذلك، فإن قياس citrulline يتطلب عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة11،12،وهو مكلف وتستغرق وقتا طويلا. في الآونة الأخيرة، أظهرنا أن مستويات سيترولين في الفئران ترتبط بشكل كبير مع وزن SI (p < 0.001) (البيانات غير المنشورة)، مما يجعل citrulline قياس مباشر يعكس كتلة الخلايا المعوية. حدّد إلى القياس من [س] وزن الحاجة للفأرة أن يكون ضحّيت ولذلك ما من يكرّس قياسات ضمن ال نفسه فأرة يمكن. ومع ذلك فإن الطريقة توفر إمكانية إجراء مجموعة متنوعة من تحليلات الأنسجة الأخرى الموجهة إلى مسألة البحث، ويمكن تصور أن هذه الحقائق يمكن أن تُوعزعن الاستخدام الإضافي للالحيوانات. ولذلك، نقترح استخدام وزن SI كعلامة حيوية سهلة ومنخفضة التكلفة وسريعة للإصابة والتكيف في الفئران. لضمان استنساخ والاختلاف التحليلي المقبول، يجب إزالة الأمعاء بعناية من الحيوان، مسح مع المالحة، أفرغت وجفت قبل وزنها. في هذه المقالة، نعرض بالضبط كيفية تنفيذ هذا الإجراء.
السمة المميزة الأخرى لداء المخاطية هو فقدان الخلايا المنتشرة في سرداب وفرط الانتشار التعويضي خلال الفترة التجديدية3. وقد استخدمت علامة الخلوية Ki67 في كثير من الأحيان لتحديد الخلايا التكاثرية السريعة عن طريق الكيمياء المناعية13. على الرغم من أن Ki67 هو علامة بسيطة من الانتشار، لديها ميل لعدم الدقة كما Ki67 موجود خلال جميع المراحل النشطة من دورة الخلية (G1، S، G2، و M)14. وضع العلامات المحددة أمر ضروري للكشف عن الخلايا المستنسخة، وهذا هو السبب في أننا نقترح في الموقع إدراج 5-برومو-2′-ديوكسيريدين (BrdU)، وهو نظير اصطناعي من الثيميدين، كما يقتصر إلى حد كبير على الخلايا المستنسخة في المرحلةS-15. يتم حقن BrdU في الحيوانات 150 دقيقة قبل التضحية ويمكن الكشف عن الخلايا في وقت لاحق مع الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة BrdU محددة. في هذه المقالة طريقة، ونحن تبين بالضبط كيفية قياس منطقة الخلايا المناعية BrdU داخل سرداب باستخدام برنامج صورة مجانية.
غالباً ما يتم دراسة التغيرات المورفولوجية والوظيفية في نماذج التهاب المخاطية المستحثة 5-FU، حيث يتم تقييم التكيف المعوي من خلال ارتفاع الزغب وعمق سرداب. خلال هذه الدراسة، وجدنا أنه خلال المرحلة الحادة من التهاب المخاطية، وهو ما يعادل مرحلة الإصابة، لا يرتبط الانتشار الذي يقاس بدمج BrdU بعمق سرداب. وعلى النقيض من ذلك، يرتبط عمق سرداب بشكل كبير مع الانتشار الذي شوهد في مرحلة إصلاح الغشاء المخاطي، بعد 3 إلى 5 أيام من الحث. وهذا يشير إلى أن المرحلة الحادة من التهاب المخاطية لا يمكن قياسها عن طريق عمق سرداب وحدها. نقترح أنه عند استخدام الانتشار كنقطة نهاية في المرحلة الحادة من الفئران الغشاء المخاطي، ينبغي أن يفضل استخدام BrdU التأسيس ولكن عند تكميم الانتشار في مرحلة لاحقة خلال مرحلة التجديد، عمق سرداب هو معقول بديل لتأسيس BrdU. وكان الهدف من هذه الدراسة لوصف هذا النموذج بطريقة يمكن استخدامها من قبل جميع الباحثين، سواء في مجال الأورام ولكن خصوصا الباحثين غير مألوفة مع نماذج الإصابات المعوية.
ويمكن استخدام النموذج الموصوف للنماذج المحورة وراثيا ً وفقاً للاستجابة التكيفية باستخدام وزن الجسم ووزن SI وعمق سرداب كنقاط نهاية. على سبيل المثال، نبين هنا كيف استخدمنا نموذج 5-fluorouracil (5-FU) التهاب المخاطية المستحث في نموذج ضرب الخلوية مع إفراز L-الخلية غير كافية16. الجلوكاجون مثل الببتيد-1 (GLP-1) والببتيد مثل الجلوكاجون-2 (GLP-2) هي الهرمونات المعوية التي تفرز هات من الخلايا L الغدد الصماء المعوية استجابة لكمية الطعام17،18. ومن المسلم به GLP-2 كعامل مهم للشفاء المعوي، وتنظيم المبرمج المخاطي وتحسين وظيفة الحاجز من SI19،20،21،22. استناداً إلى المؤلفات، افترضنا أن الهرمونات الذاتية ضرورية للانتشار المفرط التعويضي الذي يحدث في الاستجابة التكيفية بعد الإصابة.
هنا، نقوم بتوضيح طريقة يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة إصابة SI وتجديدها في نموذج الماوس. توجد مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية قبل السريرية من الإصابة المعوية، ولكن من الحيوي أن نفهم أن كل نموذج فريد من نوعه وأن نقاط النهاية يجب أن تكون مناسبة للإجابة على سؤال البحث. هذا النموذج مم…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة غير مقيدة من مركز نوفو نورديسك للبحوث الأيضية الأساسية ومؤسسة لوندبيك.
5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |