כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת נקודות קצה חשובות וסמנים מתרבים של נזקי מעיים קטנים ופיצוי יתר באמצעות מודל של mucositis המושרה כימותרפיה. אנו להדגים את הזיהוי של תאים מתרבים באמצעות מחזור התא סמן מסוים באמצעות משקל המעי קטן, עומק קריפטה, ו בגובה ליה כנקודות קצה.
עיבוד המעיים הוא מנגנון פיצוי טבעי המתרחשת כאשר המעי אובד עקב טראומה. התגובות אדפטיבית, כגון הפצת תאים קריפטה וספיגת מזון מוגבר, הם קריטיים התאוששות, עדיין מובן בצורה גרועה. הבנת המנגנון המולקולרי מאחורי התגובות אדפטיבית חיונית כדי להקל על זיהוי של חומרים מזינים או תרופות כדי לשפר את ההסתגלות. במהלך הספרות תוארו גישות ומודלים שונים, אך יש צורך באופן תיאורי מפורט לבצע את ההליכים כדי להשיג נתונים מתספרים. כאן, אנו מתארים שיטה להערכת נקודות קצה חשוב וסמנים מתרבים של פציעת מעיים קטנה ופיצוי יתר באמצעות מודל של mucositis המושרה כימותרפיה בעכברים. אנו מדגימים את הזיהוי של תאים מתרבים באמצעות סמן מחזור התא מסוים, כמו גם באמצעות משקל המעי קטן, עומק קריפטה, ו בגובה ליה כנקודות קצה. חלק מהשלבים הקריטיים בשיטה המתוארת הם הסרת ושקילה של המעי הדק ומערכת התוכנה המורכבת למדי המוצעת למדידה של טכניקה זו. לשיטות אלה יש את היתרונות שהם אינם צורכים זמן, וכי הם חסכוניים וקל לבצע ולמדוד.
עיבוד המעיים הוא מנגנון פיצוי טבעי המתרחשת כאשר המעי אובד עקב מחלה או ניתוח1,2. לאחר טראומה, הבטן עוברת תגובה אדפטיבית ופונקציונלית הסתגלות, המאופיינת על ידי התפשטות התא קריפטה וספיגת מזון מוגבר3. שלב זה הוא קריטי בהחלמה, אך מובן בצורה עלובה. מחקרים ניסיוניים של תגובת המעי האדפטיבית התמקדו השינויים המתרחשים לאחר כריתת המעי הקטן עכברים, חולדות, וחזירים, אך הבנת המנגנון המולקולרי מאחורי התגובה האדפטיבית סוגים אחרים של פציעות (g., כימיה או חיידקי) הוא חיוני כדי להקל על זיהוי של חומרים מזינים או תרופות כדי לשפר את ההסתגלות. בעבר, השתמשו בגישות שונות לתיאור האינדקס המולקולרי והסלולארי המורכב של מחלות המעי הקטנות, כולל הניקוד החילוגי ומדידת תוצאת הפציעה. למרות זאת, מה שנעדר מהספרות הוא תיאור מפורט של האופן שבו יש לבצע את ההליכים הנחוצים להשגת נתונים שאינם מופיעים. כאשר מזהים גורמים המעורבים בהסתגלות, כגון הורמוני בטן, עלות קלה, נמוכה, ומודל בעלי חיים הנקרא מוצדקת וכאן אנו מציעים באמצעות מודל של mucositis מעיים כימותרפיה (CIM).
אחת מנקודות הקצה הפשוטות והאינפורמטיביות ביותר של פגיעות והסתגלות היא למדוד את המסה של המעי הדק (SI). אנו יודעים כי סימן ההיכר של mucositis הוא אפופטוזיס של בידור, ניוון ויליוס תלויי זמן והופחת מיטוזיס. לפיכך, בחינת מורפולוגיה של המעיים רלוונטית במידה רבה למודלים קליניים4,5. בבני אדם, ירידה בחוט הפלזמה, סמן של התפקוד התפקודי, התואם לתוצאות רעילות וסמנים דלקתיים6 בנוסף לקיבולת הספיגה7, מציע שחומצת אמינו זו היא ביוארנקר מעולה של mucositis. ניתן למדוד את שורת העכבר בשני עכברים וחולדות, והוא הראה קשרים מצוינים עם אורך ליה8, קריפטה הישרדות9, ו המושרה קרינה mucositis10.
היתרון העיקרי של מדידת קו הפלזמה הוא היכולת לאסוף מדידות חוזרות ונשנות מבעל חיים אחד. עם זאת, דגימות דם מרובות בעכברים מוגבל נפח הדם הכולל של 6 μL/g/שבוע דורש הרדמה כללית. זה למרבה הצער גם מגביל את השימוש במדידות הסיטרולקו בעכברים. יתר על כן, המדידה של הסירולקו דורשת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים11,12, שהיא יקרה וגוזלת זמן. לאחרונה, הראינו כי רמות מצודות בעכברים להתאים באופן משמעותי עם משקל SI (p < 0.001) (נתונים שלא פורסמו), הפיכת קו הסירוסי למדידה ישירה המשקף המסה בידור. מגבלה למדידת משקל SI היא הצורך להקריב את העכברים ולכן אין מדידות חוזרות בתוך אותו עכבר אפשריות. עדיין השיטה מספקת את האפשרות לבצע מגוון של ניתוחי רקמות אחרים המכוונים לשאלת המחקר, ועובדות אלה יכולות לפצות על שימוש נוסף בבעלי חיים. אנו, לכן, מציעים באמצעות משקל SI קל, בעלות נמוכה, ביואריקר מהיר של פציעה והסתגלות בעכברים. כדי להבטיח שינוי וריאציה אנליטית מקובלת, יש להסיר בזהירות את המעיים מהחיה, הסמיקה בתמיסת מלח, מרוקנת ומיובשת לפני שמשקלם. במאמר זה, אנו מראים בדיוק כיצד הליך זה מבוצע.
עוד סימן ההיכר של mucositis הוא אובדן של תאים מתרבים בקריפטטים ו היפרהיפרציה פיצוי במהלך תקופת ההתחדשות3. הסמן הסלולר Ki67 השתמשו לעתים קרובות כדי לקבוע תאים מהירים מתרבים באמצעות אימונוהיסטוכימיה13. למרות Ki67 הוא סמן פשוט של התפשטות, יש לו נטייה שלא כמו Ki67 קיים במהלך כל השלבים הפעילים של מחזור התא (G1, S, G2, ו M)14. תוויות ספציפיות חיוני כדי לזהות תאים משכפלים, ולכן אנו מציעים התאגדות באתרו של 5-bromo-2′-deoxyuridine (Bromo), אנלוגי סינתטי של thymidine, כפי שהוא מוגבל ברובו לשכפול תאים ב-S-שלב15. BrdU מוזרק בעלי חיים 150 דקות לפני הקרבת ותאים יכול להיות מזוהה לאחר מכן עם אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים ספציפיים BrdU. במאמר שיטה זה, אנו מראים בדיוק כיצד למדוד את האזור של תאים אימונוdu החיסונית בתוך קריפטה באמצעות תוכנה חינם תמונה.
מורפולוגית ושינויים פונקציונליים נלמדים לעתים קרובות ב 5-פו המושרה מודלים mucositis, שבו הסתגלות המעיים מוערך על ידי הגובה והמסתורין עומק קריפטה. במהלך מחקר זה, מצאנו כי במהלך שלב אקוטי של mucositis, אשר שווה לשלב הפציעה, התפשטות שנמדד על ידי התאגדות BrdU אינו מתואם עם עומק הקריפטה. בניגוד לזה, עומק קריפטה בקורלציה משמעותית עם התפשטות לראות בשלב התיקון של mucositis, 3 כדי 5 ימים לאחר האינדוקציה. זה מרמז כי השלב האקוטי של mucositis אינו מדיד על ידי עומק קריפטה לבד. אנו מציעים כי בעת שימוש בהפצה כנקודת קצה בשלב אקוטי של עכברים mucositis, התאגדות BrdU צריך לשמש בעדיפות, אבל כאשר כימות התפשטות בשלב מאוחר יותר במהלך שלב ההתחדשות, עומק הקריפטה הוא הגיוני חלופה להתאגדות BrdU. המטרה של מחקר זה היה לתאר את המודל הזה באופן שבו זה יכול לשמש את כל החוקרים, הן בתחום האונקולוגיה, אבל במיוחד חוקרים לא מכירים מודלים לפציעה במעיים.
המודל המתואר ניתן להשתמש כדי פניטיפ מודלים על פי התגובה האדפטיבית באמצעות משקל הגוף, משקל SI ועומק קריפטה כמו נקודות קצה. לדוגמה, אנו מראים כאן כיצד השתמשנו המודל של 5-fluorouracil (5-FU) המושרה mucositis במודל הסלולר להוציא את התמונה עם הפרשה הנייד מספיק16. Glucagon כמו פפטיד-1 (glp-1) ו glucagon כמו פפטיד-2 (glp-2) הם הורמוני מעיים שכונתיות מתוך התאים האנדוקריניים L-האנדוקרינית בתגובה לצריכת מזון17,18. Glp-2 מוכר כגורם חשוב לריפוי במעיים, התקנה של אפופטוזיס רירית ושיפור תפקוד המכשול של SI19,20,21,22. בהתבסס על הספרות, אנו שיערו כי הורמונים אנדוגניים חיוניים לפיצוי היפרההפצה המתרחשים תגובה אדפטיבית לאחר הפציעה.
כאן, אנו מדגימים שיטה הנגישה באופן נרחב כדי ללמוד פציעה SI והתחדשות במודל העכבר. מגוון רחב של מודלים בעלי חיים פרה-קליניים של נזקי מעיים קיימים, אך חיוני שנבין שכל דגם הוא ייחודי ושנקודות הקצה חייבות להיות מתאימות למענה לשאלת המחקר. מודל זה מצוין כדי ללמוד תגובה אדפטיבית לפציעה, אבל נקודות ה…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי מענק בלתי מוגבל ממרכז נובו נורדיסק למחקר בסיסי מטבולית וקרן לונלבק.
5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |