Summary

Microfocus X-Ray CT (microCT) imagem latente de Actinia equina da (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), e Xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Published: August 06, 2019
doi:

Summary

Aqui, os protocolos para executar a imagem latente do tomography computado do raio X do microfoco (microct) de três animais marinhos do invertebrados são explicados em detalhe. Este estudo descreve etapas tais como a fixação da amostra, a mancha, a montagem, a exploração, a reconstrução da imagem, e as análises de dados. Sugestões sobre como o protocolo pode ser ajustado para diferentes amostras também são fornecidos.

Abstract

Tradicionalmente, os biólogos tiveram que depender de métodos destrutivos, como o corte, a fim de investigar as estruturas internas de organismos opacos. A imagem latente não-destrutiva do tomography computado do raio X do microfoco (microCT) transformou-se um protocolo poderoso e emergente na biologia, devido aos avanços tecnológicos em métodos e nas inovações de coloração da amostra no hardware de microCT, em computadores de processamento, e em dados software de análise. No entanto, este protocolo não é comumente usado, como é nos campos médico e industrial. Uma das razões para esse uso limitado é a falta de um manual simples e compreensível que cubra todas as etapas necessárias: coleta de amostras, fixação, coloração, montagem, digitalização e análise de dados. Outra razão é a grande diversidade de metazoanos, particularmente invertebrados marinhos. Por causa dos diversos tamanhos, morfologias e fisiologias dos invertebrados marinhos, é crucial ajustar as condições experimentais e as configurações de hardware em cada etapa, dependendo da amostra. Aqui, os métodos da imagem latente de microct são explicados em detalhe usando três invertebrates marinhos filogeneticamente diversos: equina da de actinia (Anthozoa, Cnidaria), SP. de harmothoe (Polychaeta, Annelida), e japonica de Xenoturbella ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Sugestões sobre a realização de imagens microCT em vários animais também são fornecidos.

Introduction

Pesquisadores biológicos geralmente tiveram que fazer cortes finos e realizar observações por microscopia de luz ou eletrônica, a fim de investigar as estruturas internas de organismos opacos. No entanto, esses métodos são destrutivos e problemáticos quando aplicados a espécimes raros ou valiosos. Além disso, várias etapas no método, como incorporação e corte, são demoradas e pode demorar vários dias para observar uma amostra, dependendo do protocolo. Além disso, ao manusear inúmeras secções, existe sempre a possibilidade de danificar ou perder algumas secções. As técnicas do tecido-esclarecimento estão disponíveis para alguns espécimes1,2,3,4,5 mas não são ainda aplicáveis para muitas espécies animais.

Para superar esses problemas, alguns biólogos começaram a usar a tomografia computadorizada de raios X microfoco (microct) Imaging6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Na TC de raios-X, o espécime é irradiado com raios-X de vários ângulos que são gerados a partir de uma fonte de raios-X movendo-se em torno da amostra, e os raios-X transmitidos são monitorados por um detector que também se move em torno da amostra. Os dados de transmissão de raios-X obtidos são analisados para reconstruir imagens transversais do espécime. Este método possibilita a observação de estruturas internas sem destruição da amostra. Por causa de sua segurança e facilidade, é comumente usado em aplicações médicas e odontológicas, e os sistemas de TC podem ser encontrados em hospitais e centros odontológicos em todo o mundo. Além disso, o raio X Industrial CT é usado freqüentemente observando amostras não médicas para a inspeção e a metrologia no campo industrial. Em contraste com a TC médica, na qual a fonte de raios X e os detectores são móveis, as duas partes são fixadas em TC Industrial, com a amostra girando durante a digitalização. A TC Industrial geralmente produz imagens de maior resolução do que a TC médica e é referida como microCT (resolução em nível de micrômetro) ou nanoCT (resolução em nível de nanômetro). Recentemente, a pesquisa usando microct aumentou rapidamente em vários campos da biologia14,15,16,17,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 anos de , 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34.

Os estudos biológicos que usam o CT inicialmente alvejou estruturas internas que consistem principalmente no tecido duro, tal como o osso. Avanços nas técnicas de coloração utilizando vários agentes químicos permitiram a visualização de tecidos moles em vários organismos6,7,8,9,14,15 , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 anos de , 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34. destes reagentes, os agentes de contraste à base de iodo são relativamente seguros, baratos e podem ser utilizados para a visualização de tecidos moles em vários organismos7,14. No que diz respeito aos invertebrados marinhos, a microtomografia tem sido amplamente utilizada em animais como moluscos6,25,32,33, anípidos18,19, 20 anos de , 28, e arthorópodes21,23,29,31. No entanto, houve poucos relatos sobre outros animais phyla, como briozoários6, xenacoelomorphs26e cnidários24,30. Em geral, houve menos estudos usando microCT em invertebrados marinhos do que aqueles em vertebrados. Uma das principais razões para este uso limitado em invertebrados marinhos é a vasta diversidade observada nestes animais. Por causa de seus diversos tamanhos, morfologias e fisiologias, cada espécie reage diferentemente a diferentes procedimentos experimentais. Portanto, é crucial durante a preparação da amostra escolher o reagente de fixação e coloração mais adequado, e definir as condições em cada etapa, ajustadas para cada espécie. Da mesma forma, também é necessário definir as configurações de digitalização, como o método de montagem, tensão, corrente, taxa de ampliação mecânica e o poder de resolução de espaço, apropriadamente para cada amostra. Para superar esse problema, um manual simples e compreensível que abrange todas as etapas necessárias, explica como cada etapa pode ser ajustada dependendo da amostra, e mostra exemplos detalhados de várias amostras é essencial.

No presente estudo, descrevemos o protocolo de imagem microCT passo a passo, desde a fixação da amostra até a análise dos dados, utilizando-se três espécies de invertebrados marinhos. Os espécimes da Anemone de mar Actinia equina da (Anthozoa, Cnidaria) foram recolhidos perto da Estação Biológica Marinha de Misaki, Universidade de Tokyo. Eles tinham um corpo esférico e macio que tinha cerca de 2 cm de diâmetro (Figura 1a-C). As amostras de Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) também foram coletadas perto da Estação Biológica Marinha Misaki. Eram vermes finos que tinham cerca de 1,5 cm de comprimento, com cerdas resistentes presentes ao longo de todo o corpo (Figura 1D). Um espécime Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) foi coletado perto do Shimoda Marine Research Center, da Universidade de Tsukuba, durante a 13ª pesquisa conjunta do organismo costeiro jambio. Era um verme macio-encorpado que tinha cerca de 0,8 cm de comprimento (Figura 1e). Os ajustes feitos para as condições e as configurações de cada amostra são explicados em detalhe. Nosso estudo fornece várias sugestões sobre como executar a imagem microCT em invertebrados marinhos, e esperamos que ele inspire os biólogos a utilizar este protocolo para sua pesquisa.

Protocol

1. fixação Para Actinia equina da, relaxe os animais em 10% MgCl2 água do mar por cerca de 15 min à temperatura ambiente. Transfira para 70% etanol e armazene à temperatura ambiente. Para Harmothoe SP., anestesiar os animais, colocando-os em água do mar gelada por cerca de 15 min. transferência para 10% (v/v) solução de formalina com água do mar e armazenar à temperatura ambiente. Para Xenoturbella japonica, relaxe o animal usando 7% MgCl…

Representative Results

Nós executamos a imagem latente de microCT em a . equina da (Anthozoa, Cnidaria), SP. de Harmothoe (Polychaeta, Annelida), e X. japonica (Xenoturbellida, xenacoelomorpha) após ter manchar as amostras com a solução de Lugol de 25%. A coloração melhorou com sucesso o contraste das estruturas internas em todos os espécimes, possibilitando observações de tecidos moles internos (Figura 6). Juntamente com os relatórios passados6,</s…

Discussion

Os fixadores que utilizam formalina, como a solução de formalina a 10% (v/v) em água salgada utilizada neste estudo, são conhecidos por preservar a morfologia de diversos invertebrados marinhos e são freqüentemente utilizados para a microtomografia computadorizada18,24,25 ,26,28,30,33

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Toshihiko Shiroishi por sua assistência e por fornecer o ambiente de pesquisa durante este estudo. Estamos gratos a Kensuke Yanagi e Takato Izumi por conselhos sobre a . equina da, e Masaatsu Tanaka para aconselhamento sobre o espécime Harmothoe SP. Gostaríamos de agradecer aos funcionários do Shimoda Marine Research Center, da Universidade de Tsukuba, e Misaki Marine Biological Station, a Universidade de Tóquio para a sua ajuda em coleções de amostras. Gostaríamos de agradecer a Editage (www.editage.jp) para edição de idioma inglês. Este trabalho foi apoiado pelo JSPS Grant-in-Aid para jovens cientistas (A) (JP26711022) para HN, e JAMBIO, Associação Japonesa de biologia marinha.

Materials

250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

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Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

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